دوره 22، شماره 4 - ( مهر و آبان 1398 )                   جلد 22 شماره 4 صفحات 123-112 | برگشت به فهرست نسخه ها


XML English Abstract Print


Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:

Sabbaghi A, Zargar M, Ghaemi A, Motamedi-Sedeh F, Zolfaghari M R. Inactivation of Human Influenza Virus Using Gamma Irradiation. J Arak Uni Med Sci 2019; 22 (4) :112-123
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6076-fa.html
صباغی آیلار، زرگر محسن، قائمی امیر، معتمدی سده فرحناز، ذوالفقاری محمد رضا. غیرفعال‌سازی ویروس آنفلوانزای انسانی (H1N1) با استفاده از پرتوی گاما. مجله دانشگاه علوم پزشكي اراك. 1398; 22 (4) :112-123

URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6076-fa.html


1- گروه میکروب‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران.
2- گروه میکروب‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد قم، دانشگاه آزاد اسلامی، قم، ایران. ، zmohsen2002@yahoo.com
3- بخش آنفلوانزا و ویروس‌های تنفسی شایع، مرکز تحقیقات ویروس‌شناسی انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران.
4- پژوهشکده کشاورزی هسته‌ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته‌ای، سازمان انرژی اتمی ایران، کرج، ایران.
متن کامل [PDF 3189 kb]   (1377 دریافت)     |   چکیده (HTML)  (2895 مشاهده)
متن کامل:   (2913 مشاهده)
مقدمه
عفونت‌های فصلی آنفلوانزا به عنوان یکی از عوامل اصلی مرگ‌و‌میر در جوامع انسانی به‌ویژه در میان افراد در معرض خطر، شامل کودکان کمتر از 5 سال و سالمندان بیشتر از 65 سال، مطرح است. از این رو، سازمان جهانی سلامت برای مقابله با بیماری‌های فصلی ناشی از ویروس آنفلوانزا، شبکه جهانی آنفلوانزا را در سال 1952 تأسیس کرد. هدف از برپایی این شبکه کنترل دریفت آنتی‌ژنیک و متعاقباً شناسایی سویه‌های ویروسی حاصل از این تغییرات، به منظور پیشنهاد محتویات واکسن آنفلوانزا برای فصل بعدی شیوع ویروس است [1]. 
امروزه طراحی واکسن بر علیه ویروس آنفلوانزا عمدتاً مبتنی بر واکسن‌های غیرفعال به‌ویژه واکسن‌های حاوی ویریون شکسته و یا ساب‌یونیت‌های آنتی‌ژنیک (پروتئین‌های HA و NA) است. کارایی محافظتی این دسته از واکسن‌ها عمدتاً به توانایی القای آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده بر علیه اسپایک‌های سطحی ویروس به‌ویژه هماگلوتینین نسبت داده می‌شود. از آنجاکه این دسته از آنتی‌بادی‌ها اختصاصی گونه هستند، قادر به واکنش متقاطع با سایر ساب‌تایپ‌های ویروس آنفلوانزای تیپ A نیستند [4-2].
 از طرفی این دسته از واکسن‌ها نیازمند ارزیابی سالیانه و اصلاح فرمولاسیون برای هماهنگی با سویه‌های درحال گردش ناشی از آنتی‌ژنیک دریفت نیز هستند. این امر فشار زیادی بر تولیدکنندگان و مقامات نظارتی برای تصمیم‌گیری صحیح در رابطه با فرمولاسیون مناسب واکسن در هر سال اعمال می‌کند [6 ،5].
علاوه بر اپیدمی‌های فصلی، ویروس‌های آنفلوانزایی که از حیوانات منشأ گرفته‌اند نیز می‌توانند به سهولت از طریق تبادل قطعات ژنی (آنتی‌ژنیک شیفت) با میزبان‌های انسانی سازگار شوند. بدین ترتیب با ظهور ساب‌تایپ‌های جدیدی از ویروس آنفلوانزا با خواص آنتی‌ژنیک متمایز، کارایی محافظتی واکسن‌های فصلی آنفلوانزا کاهش می‌یابد [5]. از این رو برای غلبه بر ایمنی‌زایی کم اسپیلیت واکسن‌ها و یا واکسن‌های ساب‌یونیت برای تحریک لنفوسیت‌های تی، توجهات به طور عمده بر توسعه واکسن‌های غیرفعال کامل معطوف شده است. به طور کلی حفظ یکپارچگی اپیتوپ‌های ایمونوژنیک ویروس، در طی مراحل سنتز واکسن در اثربخشی هرچه بهتر واکسن مؤثر است. این نکته، امکان شناسایی طیف وسیعی از سویه‌های ویروس آنفلوانزا از سوی سیستم ایمنی به واسطه هدف‌قرار‌دادن اپیتوپ‌های محافظت‌شده از پروتئین‌های ویروس آنفلوانزا را فراهم می‌آورد [9-7]. 
ویروس‌های آنفلوانزای غیرفعال کامل، صرف نظر از روش غیرفعال‌سازی قادر به القا و تحریک لنفوسیت‌ها هستند [2]. از روش‌های متداول غیرفعال‌سازی ویروس آنفلوانزا می‌توان به تیمارهای شیمیایی با استفاده از فرمالین و بتا پروپیولاکتون و همچنین تیمارهای فیزیکی از قبیل اشعه گاما و UV اشاره کرد [3 ،2]. از آنجاکه در مقایسه با تیمارهای شیمیایی و اشعه UV، ساختارهای آنتی‌ژنیک ویروس‌های آنفلوانزای غیرفعال‌شده به واسطه اشعه گاما تا حد بسیاری در طی تیمار بدون تغییر باقی می‌مانند، علاوه بر القای ایمنی همورال منجر به برانگیخته‌شدن پاسخ تی‌سل های سایتوتوکسیک افکتور و خاطره قوی‌تر با قابلیت ایجاد واکنش متقاطع با ساب‌تایپ‌های مختلف از ویروس آنفلوانزا در موش می‌شوند [10 ،9]. بدین ترتیب،‌ γ-FLU ها با کارایی حفاظتی بالا در برابر واریانت‌های آنتی‌ژنیکی ویروس، کاندید مناسبی هستند برای تولید واکسن‌های فراگیر و جایگزینی با واکسن‌های فعلی که عمدتاً منجر به القای تولید آنتی‌بادی می‌شوند [11 ،2]. 
در این تحقیق از پرتو گاما به منظور غیرفعال‌سازی سویه ویروس آنفلوانزای انسانی با عنوان A/PR/8/34 [A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)]، به عنوان کاندیدی برای تولید واکسن‌های ویروسی غیرفعال کامل استفاده شد.

 مواد و روش‌ها
کشت سلول

 رده سلولی اپیتلیوم کلیه سگ‌سانان از بانک سلولی انستیتو پاستور تهران تهیه شد. سپس به صورت تک‌لایه در داخل فلاسک‌های استریل 175 سانتی‌متر مربع فیلتردار به همراه محیط کشت حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی غیرفعال‌شده به همراه آنتی‌بیوتیک پنیسیلین (100 واحد در میلی لیتر)/ استرپتومایسین (100 میکروگرم در میلی لیتر) (همه از شرکت Gibco، Germany) کشت داده شد. انکوباسیون فلاسک‌ها به مدت 24 ساعت در گرم‌خانه 37 درجه سانتی‌گراد به همراه 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت صورت گرفت.
ویروس
 در پژوهش حاضر از سویه ویروس آنفلوانزای انسانی تحت عنوان A/PR/8/34 [A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)] با تیتر اولیه ml/ 6‌10 استفاده شد. این سویه از بخش آنفلوانزا انستیتو پاستور تهران تهیه شد.
تعیین ضریب آلودگی بهینه
ضریب آلودگی، نسبت تعداد ذرات ویروسی به ازای یک سلول است [12]. از این رو، حجم مناسب ویروس برای آلوده‌کردن سلول‌های رده MDCK بر مبنای ضریب آلودگی تعیین شد. برای این امر، 100 میکرولیتر محیط حاوی 20 هزار سلول MDCK پاساژ 4 برای شکل‌گیری سلول‌های تک‌لایه با تراکم 70 درصد به همراه محیط کشت DMEM واجد آنتی‌بیوتیک Pen-Strep و 10 درصد سرم گاوی به هر چاهک پلیت 96 خانه‌ای ته‌صاف افزوده شد و پس از 24 ساعت انکوباسیون در گرم‌خانه 37 درجه سانتی‌گراد به همراه 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت، تلقیح ویروس با تیتر اولیه ml/۶‌10 در MOI های 1 تا 20 بر روی سلول‌های تک‌لایه صورت گرفت. برای هر ضریب آلودگی، 3 چاهک با شرایط یکسان در نظر گرفته شد. متعاقباً سرعت تخریب سلول‌ها به واسطه تکثیر ویروس در زمان‌های مختلف برای تعیین ضریب آلودگی مناسب ارزیابی شد. 
تلقیح ویروس و ارزیابی سلول‌های آلوده
 پس از شکل‌گیری سلول‌های تک‌لایه با تراکم 70 درصد، تلقیح ویروس با ضریب آلودگی 6 به‌عنوان دز بهینه به داخل فلاسک‌های 175سانتی‌متر مربع صورت گرفت. بدین ترتیب که پس از دو بار شست‌وشوی سلول‌ها با فسفات بافر استریل، 3 سی‌سی محیط حاوی ویروس به همراه 3 سی‌سی محیط کشت فاقد آنتی‌بیوتیک به داخل فلاسک حاوی سلول تلقیح شد. سپس فلاسک‌ها به مدت یک ساعت و نیم در گرم‌خانه 37 درجه سانتی‌گراد به همراه 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت انکوبه و هر 15 دقیقه تکان داده شدند. پس از اتمام مدت زمان انکوباسیون و خروج محیط حاوی ویروس، محیط کشت جدید DMEM به همراه آنزیم Tolylsulfonyl phenylalanyl chloromethry ketone (TPCK, 1µg/ml) (Merck, Germany) به داخل فلاسک‌ها افزوده شد و انکوباسیون به مدت 48 ساعت صورت گرفت. پس از اتمام مدت زمان انکوباسیون و مشاهده علائم سایتوپاتوژنیک شامل گردشدن و جداشدن سلول‌ها از سطح فلاسک، جمع‌آوری ویروس به واسطه سانتریفیوژ محتویات فلاسک‌ها در دمای 4درجه سانتی‌گراد با سرعت 3000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه صورت گرفت. 
تغلیظ ویروس با استفاده از اولترافیلتراسیون
 برای تغلیظ ویروس و جداسازی هرچه بیشتر سلول‌ها، دبری‌های سلولی به‌ویژه پروتئین‌ها و DNA سلولی و همچنین سایر ذرات نامحلول موجود در محیط حاوی ویروس از سیستم اولترافیلتراسیون با فیلتر 100 کیلو دالتون استفاده شد. در این سیستم، تغلیظ ویروس به واسطه گردش محیط حاوی ویروس صورت می‌پذیرد. بدین ترتیب که محیط وارد‌شده به سیستم با فیلتر 100 کیلو دالتون مجاور شده و از آن عبور می‌کند. در این حالت، مولکول‌های بزرگ‌تر (ویروس آنفلوانزا (5 × 103 KD)) از فیلتر عبور نکرده و دوباره به ظرف اصلی بازمی‌گردند و بازچرخش می‌شوند؛ اما مولکول‌های کوچک‌تر، از فیلتر عبور کرده و به ظرف ضایعات انتقال می‌یابند. این گردش منجر به تغلیظ ویروس می‌شود [14 ،13]. درنهایت سوسپانسیون ویروسی تغلیظ‌شده در کرایوتیوپ‌های واشردار دو سی‌سی تقسیم و در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد تا زمان پرتوتابی با اشعه گاما نگه‌داری شد.
تیتراسیون ویروس تغلیظ‌شده با استفاده از تست TCID50% 
مقدار ویروس تغلیظ‌شده در واحد میلی‌لیتر که توان ایجاد CPE در 50 درصد از یاخته‌های تلقیح‌داده‌شده را دارد، با استفاده از فرمول کربر محاسبه شد [15]. برای این کار، 100 میکرولیتر محیط حاوی 20 هزار سلول MDCK پاساژ 4 برای شکل‌گیری سلول‌های تک‌لایه با تراکم 70 درصد به همراه محیط کشت DMEM واجد آنتی‌بیوتیک Pen-Strep و 10 درصد سرم گاوی به هر چاهک پلیت 96 خانه‌ای ته‌صاف افزوده شد و پس از 24 ساعت انکوباسیون در گرم خانه 37 درجه سانتی‌گراد به همراه 5 درصد CO2 و 95 درصد رطوبت، تلقیح ویروس از رقت‌های صفر تا 12-10 بر روی سلول‌های تک‌لایه صورت گرفت. برای هر رقت، 4 چاهک با شرایط یکسان در نظر گرفته شد. متعاقباً پس از 48 ساعت انکوباسیون، TCID50 بر مبنای CPE و فرمول کربر محاسبه شد.
دزسنجی و پرتوتابی با اشعه گاما
24 ساعت قبل از پرتوتابی، ویال‌های حاوی دو سی‌سی ویروس تغلیظ‌شده با تیتر اولیه مشخص به ظرف Cryo 1°C Cooler (International Atomic Energy Agency: IAEA, Austria) انتقال یافت و در فریزر 70- درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شد. سپس ظرف حاوی نمونه به پژوهشکده کاربرد پرتوها واقع در سازمان انرژی اتمی ایران انتقال و به همراه یخ در دستگاه گاما سل 220 با نرخ دز1/42 گری بر ثانیه و اکتیویته 6048 کوری قرار داده شد. متعاقباً پرتوتابی با دزهای 5، 10، 15، 20، 25، 28 و 30 کیلوگری (دو تکرار برای هر دز تابش) توسط دستگاه صورت گرفت. کالیبراسیون دستگاه گاماسل نیز طبق دزیمتری استاندارد فریک توسط پژوهشکده انجام شد [16]. 
محاسبه دز بهینه غیرفعال‌سازی بر حسب کیلوگری
پس از پرتوتابی، تیتر عفونت‌زایی ویروسی برای هر دو تکرار هر دز به روش (TCID 50%) تعیین شد. متعاقباً با استفاده از نرم‌افزار Origin6.1 منحنی دز/ پایندگی ترسیم شد. فاکتور D10 Value و دز بهینه غیر‌فعال‌سازی بر حسب کیلوگری نیز به با توجه به معادله بهترین خط عبوری از نمودار و تیتر عفونت‌زایی اولیه ویروس محاسبه شد [17].
تأیید غیرفعال‌سازی کامل ویروس پرتوتابی‌شده با دز بهینه با استفاده از آزمون بی‌ضرری
 نمونه‌های ویروسی پرتوتابی شده با دزهای 25، 28 و30 کیلوگری (دو تکرار برای هر دز تابش) طی چهار پاساژ متوالی بر روی رده سلولی MDCK با شرایط مشابه تلقیح شدند و از نظر تکثیر و ایجاد علائم CPE بررسی شدند. بدین ترتیب که در پاساژ اول پس از 48 ساعت انکوباسیون از مایع رویی روی یک فلاسک حاوی سلول تازه، کشت داده شد. این امر تا 4 پاساژ تکرار شد و 48 ساعت پس از هر پاساژ، علائم تکثیر ویروس ارزیابی شد [17].

بررسی حفظ خواص آنتی‌ژنیکی ویروس پرتوتابی‌شده نسبت به شاهد (ویروس پرتوتابی‌نشده) با استفاده از تست هماگلوتیناسیون
 از روش استاندارد HA برای ارزیابی حفظ ساختارهای آنتی‌ژنیک ویروس پرتوتابی‌شده نسبت به شاهد استفاده شد [18 ،11]. برای این امر، ویروس شاهد و پرتوتابی‌شده در رقت‌های سریالی در حجم 50 میکرولیتر به داخل چاهک‌های پلیت 96 خانه‌ای Uشکل کشت سلول انتقال یافت (دو تکرار برای هر ویروس). سپس 50 میکرولیتر سوسپانسیون گلبول‌های قرمز خون جوجه با رقت نیم درصد به تمامی چاهک‌ها اضافه شد و به مدت یک ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. متعاقباً الگوی هماگلوتیناسیون پس از انکوباسیون ارزیابی شد.
در پژوهش حاضر با توجه به احتمال خطای ابزاری و تکنیکی در روش‌های مختلف، با تکرارها و انتخاب میانگین سعی‌شده است که امکان خطا به حداقل خود برسد که در این مطالعه همسانی نتایج دلالت بر خطای محدود در ابزار و روش به‌کارگیری داشت.

یافته‌ها
ارزیابی ضریب‌های آلودگی 1 تا 20 پس از 48 ساعت انکوباسیون نشان داد تعیین ضریب آلودگی بهینه وابسته به زمان است و در زمان‌های مختلف، اثرات CPE در چاهک‌های مختلف تغییر می‌کند. به عنوان مثال در زمان کمتر از 20 ساعت، ضریب آلودگی 20 با 95 درصد CPE به عنوان ضریب آلودگی بهینه در نظر گرفته می‌شود. برای تکمیل سیکل ویروس و کاهش میزان تولید ذرات شبه‌ویروسی، ضریب آلودگی 6 با دوره انکوباسیون 48ساعته انتخاب شد. یاخته‌های سالم MDCK در مقابل یاخته‌های آلوده به ویروس، در تصویر شماره 1 نشان داده شده است.
با توجه به نتایج مرتبط با تیتر ویروس قبل از پرتودهی و پس از پرتو (جدول شماره 1) و با استفاده از نرم‌افزار Origin6.1، منحنی دز/ پایندگی (تصویر شماره 2) ترسیم و معادله شماره ۱ به عنوان بهترین خط عبوری از منحنی تعیین شد.
۱. 
  
 



 

فاکتور D10 Value (دزی از پرتو گاما بر حسب کیلوگری که منجر به کاهش جمعیت ویروسی به میزان یک سیکل لگاریتمی می‌شود) [19] نیز بر مبنای معادله بهترین خط عبوری از نمودار، 878/4 کیلوگری محاسبه شد. از آنجا که تیتر اولیه ویروس تغلیظ‌شده معادل با ml/ 5.75‌10 است، برای غیرفعال‌سازی کامل ویروس نیاز است که تیتر ویروسی به میزان 75/5 سیکل کاهش یابد. از این رو، دز بهینه به شیوه معادله شماره ۲ و برابر با 048/28 کیلو گری محاسبه شد.
۲.

28/048=4/878× 5/75=دز بهینه برای غیرفعالسازی کامل ویروس برحسب کیلوگری 


با توجه به نتایج مندرج در رابطه با 4 پاساژ از نمونه‌های پرتوتابی‌شده در دزهای 28 و 30 کیلوگری (جدول شماره 2) و همچنین نتایج مربوط به بررسی حفظ قابلیت خواص آنتی‌ژنیک سطحی ویروس پرتوتابی‌شده (جدول شماره 3)، دز 28 کیلوگری به عنوان دز بهینه تابش گاما برای غیرفعال‌سازی کامل ویروس آنفلوانزای انسانی با تیتر اولیه ml/ 10(به توان 5/75) به واسطه حفظ ساختارهای آنتی‌ژنیک سطحی و همچنین رؤیت‌نکردن علائم تکثیر ویروس در طی 4 پاساژ متوالی تعیین شد. بر اساس نتایج مندرج در جدول شماره 3، خاصیت آنتی‌ژنیک دمین‌های سطحی ویروس آنفلوانزا تا دز 30 کیلوگری (رقت1/512 ویروس) نیز حفظ شده است.






بحث
آنتی‌ژن‌های ذره‌ایی از قبیل WIVها واجد بسیاری از اپیتوپ‌های ایمونوژنیک و اجزای محرک ایمنی از قبیل لیگاندهای گیرنده‌های سلولی به نام گیرنده‌های شناساگر الگو برای القای یک پاسخ ایمنی مؤثر بر علیه ویروس هستند [21 ،20]. توجه به این نکته الزامی است که القای پاسخ‌های ایمنی در رابطه با واکسن‌های WIV نیاز به حفظ ساختار و شناسایی اپیتوپ‌های آنتی‌ژنیک توسط سیستم ایمنی میزبان دارد. غیرفعال‌سازی ویروس آنفلوانزا با استفاده از تیمارهای شیمیایی نظیر فرمالین و یا بتا پروپیولاکتون منجر به القای برهم‌کنش و اتصال متقاطع پروتئین‌های ویروسی می‌شود. از این رو، قابلیت نفوذ ویروس‌های غیرفعال به داخل سیتوزول سلول‌های میزبان کاهش می‌یابد. تیمارهای فیزیکی از قبیل اشعه UV نیز از طریق اختلال در فعالیت غشاء لیپیدی ویروس منجر به کاهش برداشت مؤثر این دسته از ویروسها به واسطه سلولهای عرضه کننده آنتی‌ژن می‌شوند. بدین ترتیب، کاهش عرضه آنتی‌ژن‌های ویروسی ممکن است منجر به کاهش کارایی این دسته از واکسن‌ها شود. 
تیمارهای مذکور بر روی نمونه‌های غیریخ‌زده ویروسی صورت می‌گیرد. در این حالت، تخریب ناخواسته دمین‌های آنتی‌ژنیک ویروس به واسطه تولید ترکیبات توکسیک به ویژه رادیکال‌های آزاد در طی فرایند غیرفعال‌سازی، اجتناب‌ناپذیر است [22 ،11 ،2].
در مقابل، اثر ضدویروسی اشعه گاما عمدتاً با بروز آسیب در اسید نوکلئیک ویروس شامل شکستگی در ژنوم ویروسی، شکستگی‌های متقاطع یا بروز آسیب‌های نوکلئوتیدی مرتبط است [19]. از طرفی تابش گاما برای غیرفعال‌سازی بر روی نمونه‌های ویروسی یخ‌زده نیز اعمال‌پذیر است. برای این منظور در طی تابش اشعه گاما، ذخایر ویروسی یخ‌زده روی یخ خشک نگه‌داری می‌شوند. این کار باعث به‌حداقل‌رساندن بروز آسیب‌های ناخواسته بر ساختارهای پروتئینی در طی فرایند غیرفعال‌سازی ویروس می‌شود. این موضوع به عنوان یک مزیت بزرگ نسبت به سایر روش‌های سنتی استریلیزاسیون به‌ویژه در زمینه تولید واکسن مطرح است [23]. 
استفاده از تابش گاما برای غیرفعال‌سازی ویروس‌ها را ابتدا در سال 1955 پولارد و همکارانش بررسی کردند [24] و در پی آن، غیرفعال‌سازی ویروس تب برفکی به واسطه تابش گاما در سال 1973 را فرسکورا و همکاران ارزیابی کردند. نتایج حاصل از این تحقیق حاکی از این بود که آنتی‌ژنیسیته ویروس‌های لیوفیلیزه FMD تایپ‌های 01، 02 و 07 پس از تابش مشابه با ویروس‌های لیوفیلیزه پرتوتابی نشده است. این نکته نشان‌دهنده حفظ دمین‌های عملکردی ویروس در طی تیمار است [25]. بر این اساس، زمینه مورد نیاز برای مطالعات بیشتر در رابطه با کاربرد تابش گاما در صنایع واکسن‌سازی مهیا شد.
الشریفی و همکاران در سال 2009 نشان دادند که استفاده از یک دز از ویروس آنفلوانزای غیر‌فعال‌شده با اشعه گاما موسوم به/PR8 متعلق به ساب‌تایپ H1N1 به صورت استنشاقی منجر به محافظت موش در برابر ویروس‌های کشنده آنفلوانزای مرغی با ساب‌تایپ H5N1 و همچنین سایر ساب‌تایپ‌های آنفلوانزا در موش می‌شود. از این رو، γ- FLU vaccine ها نه‌تنها می‌توانند منجر به ایجاد محافظت در برابر عفونت‌های فصلی آنفلوانزا شوند بلکه این امکان نیز وجود دارد که در رابطه با پاندمی‌های آینده ناشی از ویروس آنفلوانزای مرغی نیز مؤثر باشند [10].
فورویا و همکاران در سال 2010 نشان دادند که γ-inactivated A/PC [A/Port Chalmers/1/73 (H3N2)] virus در مقایسه با ویروس‌های غیر‌فعال‌شده به واسطه فرمالین و اشعه UV و همچنین در برابر واکسن‌های تجاری آنفلوانزای سه‌ظرفیتی فعلی از ایمنی‌زایی بسیار بیشتری برخوردار است به نحوی که تنها یک دز از γ- A/PC vaccine منجر به حفاظت درخور توجهی در برابر ویروس‌های همولوگ و هترولوگ آنفلوانزا در موش می‌شود [2]. 
با توجه به مزایای ذکرشده، تابش گاما برای غیرفعال‌سازی ویروس آنفلوانزای انسانی استفاده شده است. در مطالعه حاضر از سلول‌های رده MDCK برای تکثیر و جمع‌آوری ویروس آنفلوانزای انسانی با عنوان A/PR/8/34 [A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)] استفاده شد. رده سلولی MDCK به علت بیان گیرنده‌های اسید سیالیک از نوع آلفا-2و 6 و آلفا-2و 3 به عنوان یک مدل مطالعاتی مناسب برای ویروس‌های آنفلوانزا مطرح است [26]. از طرفی نتایج جدول شماره 1 حاکی از کاهش خاصیت عفونت‌زایی ویروس پرتوتابی‌شده نسبت به ویروس شاهد از دز 5 کیلو گری به بالاست، به نحوی که در دزهای 28 و 30 کیلوگری خاصیت عفونت‌زایی ویروس به صفر می رسد. متعاقباً بر اساس تست HA نیز مشخص شد که خاصیت آنتی‌ژنیک دمین‌های سطحی ویروس پرتوتابی‌شده نسبت به ویروس پرتودهی‌نشده از دز 5 تا دز 30 کیلوگری حفظ شده است. از این رو، دز 28 کیلوگری به عنوان دز بهینه برای غیرفعال‌سازی کامل نمونه‌های ویروسی انتخاب شد. نتایج فوق منطبق بر مطالعه انجام شده به واسطه صالحی و معتمدی‌سده در سال 2018 بود. در این مطالعه گرچه غیرفعال‌سازی کامل ویروس آنفلوانزای مرغی ساب‌تایپ H9N2 در دز 29/52 کیلوگری صورت گرفت، خاصیت آنتی‌ژنیسیته دمین‌های سطحی ویروس پرتوتابی‌شده نسبت به ویروس پرتوتابی‌نشده تا دز 30 کیلوگری نیز حفظ شده است [27]. 
نتیجه‌گیری
در این مطالعه برای حفظ بیشتر ساختارهای ایمونوژنیک ویروس آنفلوانزا در طی فرایند غیرفعال‌سازی از نمونه‌های یخ‌زده ویروسی استفاده شد. اما از آنجا که دستگاه گاماسلِ استفاده‌شده قابلیت تنظیم دما را ندارد، بهتر است در مطالعات بعدی از آنتی‌اکسیدانت‌هایی نظیر کمپلکس سنتتیک و یا اسکونجرهای رادیکال‌های آزاد از قبیل تتراسایکلین هیدروکلراید و آسکوربات [30-28] برای جلوگیری از آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از رادیولیز مولکول‌های آب به واسطه تابش گاما استفاده شود. نتایج حاصل از این پژوهش به‌ویژه حفظ ساختارهای آنتی‌ژنیک ویروس آنفلوانزا، در دزهای بالای تابش گاما (28 و 30 کیلو گری) می‌تواند زمینه‌ای برای مطالعات بیشتر در رابطه با کاربرد تابش گاما در صنایع واکسن‌سازی ایجاد نماید.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه با شناسه IR.IAU.TMU.REC.1397.309 در کمیته پژوهشی دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی آزاد تهران به ثبت رسیده است.
حامی مالی
این مقاله حاصل پایان‌نامه دکتری آیلار صباغی در گروه میکروب‌شناسی، دانشکده علوم پایه ، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد قم با شماره 508333 است.
مشارکت نویسندگان
تمامی نویسندگان معیارهای استاندارد نویسندگی بر اساس پیشنهادهای کمیته بین‌المللی ناشران مجله پزشکی (ICMJE) را دارا بودند.
تعارض منافع
نویسندگان تصریح می‌کنند هیچ‌گونه تضاد منافعی در خصوص پژوهش حاضر وجود ندارد.
References
  1. Carrat F, Flahault A. Influenza vaccine: The challenge of antigenic drift. Vaccine. 2007; 25(39-40):6852-62. [DOI:10.1016/j.vaccine.2007.07.027] [PMID]
  2. Furuya Y, Regner M, Lobigs M, Koskinen A, Mullbacher A, Alsharifi M. Effect of inactivation method on the cross-protective immunity induced by whole ‘killed’ influenza A viruses and commercial vaccine preparations. J Gen Virol. 2010; 91(Pt 6):1450-60. [DOI:10.1099/vir.0.018168-0] [PMID]
  3. Budimir N, Huckriede A, Meijerhof T, Boon L, Gostick E, Price DA, et al. Induction of heterosubtypic cross-protection against influenza by a whole inactivated virus vaccine: The role of viral membrane fusion activity. PLOS One. 2012; 7(1):e30898. [DOI:10.1371/journal.pone.0030898] [PMID] [PMCID]
  4. Geeraedts F, Goutagny N, Hornung V, Severa M, de Haan A, Pool J, et al. Superior immunogenicity of inactivated whole virus H5N1 influenza vaccine is primarily controlled by Toll-like receptor signalling. PLOS Pathog ens. 2008; 4(8):e1000138. [DOI:10.1371/journal.ppat.1000138] [PMID] [PMCID]
  5. Fotouhi F, Shaffifar M, Farahmand B, Shirian S, Saeidi M, Tabarraei A, et al. Adjuvant use of the NKT cell agonist alpha-galactosylceramide leads to enhancement of M2-based DNA vaccine immunogenicity and protective immunity against influenza A virus. Arch Virol. 2017; 162(5):1251-60. [DOI:10.1007/s00705-017-3230-7] [PMID]
  6. Treanor JJ. Prospects for broadly protective influenza vaccines. Vaccine. 2015; 33(Suppl. 4):D39-D45. [DOI:10.1016/j.vaccine.2015.08.053] [PMID]
  7. Kreijtz J, Fouchier R, Rimmelzwaan G. Immune responses to influenza virus infection.Virus Res. 2011; 162(1-2):19-30. [DOI:10.1016/j.virusres.2011.09.022] [PMID]
  8. van de Sandt CE, Kreijtz JH, Rimmelzwaan GF. Evasion of influenza A viruses from innate and adaptive immune responses. Viruses. 2012; 4(9):1438-76. [DOI:10.3390/v4091438] [PMID] [PMCID]
  9. Müllbacher A, Ada G, Tha Hla R. Gamma‐irradiated influenza A virus can prime for a cross‐reactive and cross‐protective immune response against influenza A viruses. Immunol Cell Biol. 1988; 66(2):153-7. [DOI:10.1038/icb.1988.19] [PMID]
  10. Alsharifi M, Furuya Y, Bowden TR, Lobigs M, Koskinen A, Regner M, et al. Intranasal flu vaccine protective against seasonal and H5N1 avian influenza infections. PLOS One. 2009; 4(4):e5336. [DOI:10.1371/journal.pone.0005336] [PMID] [PMCID]
  11. Furuya Y, Chan J, Wan EC, Koskinen A, Diener KR, Hayball JD, et al. Gamma-irradiated influenza virus uniquely induces IFN-I mediated lymphocyte activation independent of the TLR7/MyD88 pathway. PLOS One. 2011; 6(10):e25765. [DOI:10.1371/journal.pone.0025765] [PMID] [PMCID]
  12. González-Jara P, Fraile A, Canto T, García-Arenal F. The multiplicity of infection of a plant virus varies during colonization of its eukaryotic host. J Virol Methods. 2009; 83(15):7487-94. [DOI:10.1128/JVI.00636-09] [PMID] [PMCID]
  13. Wickramasinghe S, Kalbfuss B, Zimmermann A, Thom V, Reichl U. Tangential flow microfiltration and ultrafiltration for human influenza A virus concentration and purification. Biotechnol Bioeng. 2005; 92(2):199-208. [DOI:10.1002/bit.20599] [PMID]
  14. Kalbfuss B, Genzel Y, Wolff M, Zimmermann A, Morenweiser R, Reichl U. Harvesting and concentration of human influenza A virus produced in serum‐free mammalian cell culture for the production of vaccines. Biotechnol Bioeng. 2007; 97(1):73-85. [DOI:10.1002/bit.21139] [PMID]
  15. Ramakrishnan MA. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World J Virol. 2016; 5(2):85-6. [DOI:10.5501/wjv.v5.i2.85] [PMID] [PMCID]
  16. American Society For Testing and Materials. Standard practice for using the fricke reference standard dosimetry system. Barr Harbor: ASTM International West Conshohocken; 2004.
  17. Motamedi-Sedeh F, Mahravani H, Javadi M, Harzandi N, Shafaei SK. FMD virus type Asia-1 irradiated vaccine and evaluation of immune response on guinea-pig model. Biol J Microorganism. 2017; 6(23):57-66.
  18. Killian ML. Hemagglutination assay for influenza virus. Methods in Mol Biol. 2014; 1161:3-9. [DOI:10.1007/978-1-4939-0758-8_1] [PMID]
  19. Alsharifi M, Müllbacher A. The γ-irradiated influenza vaccine and the prospect of producing safe vaccines in general. Immunol Cell Biol. 2010; 88(2):103. [DOI:10.1038/icb.2009.81] [PMID]
  20. Tsen S-WD, Donthi N, La V, Hsieh WH, Li YD, Knoff J, et al. Chemical-free inactivated whole influenza virus vaccine prepared by ultrashort pulsed laser treatment. J Biomed Optics. 2014; 20(5):051008. [DOI:10.1117/1.JBO.20.5.051008] [PMID] [PMCID]
  21. Barrett PN, Terpening SJ, Snow D, Cobb RR, Kistner O. Vero cell technology for rapid development of inactivated whole virus vaccines for emerging viral diseases. Expert Rev Vaccines. 2017; 16(9):883-94. [DOI:10.1080/14760584.2017.1357471] [PMID]
  22. Furuya Y, Chan J, Regner M, Lobigs M, Koskinen A, Kok T, et al. Cytotoxic T cells are the predominant players providing cross-protective immunity induced by γ-irradiated influenza A viruses. J Virol. 2010; 84(9):4212-21. [DOI:10.1128/JVI.02508-09] [PMID] [PMCID]
  23. David SC, Lau J, Singleton EV, Babb R, Davies J, Hirst TR, et al. The effect of gamma-irradiation conditions on the immunogenicity of whole-inactivated Influenza A virus vaccine. Vaccine. 2017; 35(7):1071-9. [DOI:10.1016/j.vaccine.2016.12.044] [PMID]
  24. Pollard E. The action of ionizing radiation on viruses. In: Kenneth M. Smith, Max A, Lauffer, editors. Advances in Virus Research. Edinburgh: Elsevier; 1954. [DOI:10.1016/S0065-3527(08)60531-X]
  25. Frescura T, Vivoli P. Studies of the foot‐and‐mouth disease virus sub‐types using antigens inactivated by Gamma radiations. Zentralblatt Fur Veterinarmedizin. Reihe B. J Vet Med. 1973; 20(10):822-5. [DOI:10.1111/j.1439-0450.1973.tb02055.x] [PMID]
  26. Lugovtsev VY, Melnyk D, Weir JP. Heterogeneity of the MDCK cell line and its applicability for influenza virus research. PLOS One. 2013; 8(9):e75014. [DOI:10.1371/journal.pone.0075014] [PMID] [PMCID]
  27. Salehi B, Motamedi-Sedeh F, Madadgar O, Khalili I, Ghalyan Chi Langroudi A, et al. Analysis of antigen conservation and inactivation of gamma-irradiated avian influenza virus subtype H9N2. Acta microbiologica et Immunologica Hungarica. 2018; 65(2):163-71. [DOI:10.1556/030.65.2018.025] [PMID]
  28. Grieb T, Forng RY, Brown R, Owolabi T, Maddox E, Mcbain A, et al. Effective use of gamma irradiation for pathogen inactivation of monoclonal antibody preparations. Biologicals. 2002; 30(3):207-16. [DOI:10.1006/biol.2002.0330] [PMID]
  29. Gayen M, Gupta P, Morazzani EM, Gaidamakova EK, Knollmann-Ritschel B, Daly MJ, et al. Deinococcus Mn(2+)-peptide complex: A novel approach to alphavirus vaccine development. Vaccine. 2017; 35(29):3672-81. [DOI:10.1016/j.vaccine.2017.05.016] [PMID]
  30. Alok A, Chaudhury N. Tetracycline hydrochloride: A potential clinical drug for radioprotection. Chemico-Biological Interact. 2016; 245:90-9. [DOI:10.1016/j.cbi.2016.01.001] [PMID]
نوع مطالعه: پژوهشي اصیل | موضوع مقاله: علوم پایه
دریافت: 1398/2/23 | پذیرش: 1398/6/2

ارسال نظر درباره این مقاله : نام کاربری یا پست الکترونیک شما:
CAPTCHA

ارسال پیام به نویسنده مسئول


بازنشر اطلاعات
Creative Commons License این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است.

کلیه حقوق این وب سایت متعلق به مجله دانشگاه علوم پزشکی اراک می باشد.

طراحی و برنامه نویسی : یکتاوب افزار شرق

© 2024 CC BY-NC 4.0 | Journal of Arak University of Medical Sciences

Designed & Developed by : Yektaweb