دوره 22، شماره 5 - ( آذر و دی 1398 )
جلد 22 شماره 5 صفحات 89-78 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Poorsoleiman M S, Hosseini S A, Etminan A, Abtahi H, Koolivand A. The Efficiency of Acinetobacter Radioresistens Strain KA2 Isolated From Oily Sludge for Degrading of Crude Oil . J Arak Uni Med Sci 2019; 22 (5) :78-89
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6083-fa.html
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6083-fa.html
پورسلیمان محمدسعید، حسینی سید احمد، اطمینان علیرضا، ابطحی حمید، کولیوند علی. شناسایی و بررسی کارایی باکتری بومی Acinetobacter radioresistens strain KA2 جداسازی‌شده از لجن‌های نفتی جهت تجزیه نفت خام. مجله دانشگاه علوم پزشكي اراك. 1398; 22 (5) :78-89
محمدسعید پورسلیمان1 
، سید احمد حسینی1 ، علیرضا اطمینان2 ، حمید ابطحی3 ، علی کولیوند 4
، سید احمد حسینی1 ، علیرضا اطمینان2 ، حمید ابطحی3 ، علی کولیوند 4
1- گروه منابع طبیعی و محیط زیست، واحد کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمانشاه، ایران.
2- گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، واحد کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمانشاه، ایران.
3- مرکز تحقیقات پزشکی و مولکولی، دانشگاه علوم‌پزشکی اراک، اراک، ایران.
4- گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم‌پزشکی اراک، اراک، ایران. ، alikoluvand@arakmu.ac.ir
2- گروه بیوتکنولوژی و اصلاح نباتات، واحد کرمانشاه، دانشگاه آزاد اسلامی، کرمانشاه، ایران.
3- مرکز تحقیقات پزشکی و مولکولی، دانشگاه علوم‌پزشکی اراک، اراک، ایران.
4- گروه مهندسی بهداشت محیط، دانشکده بهداشت، دانشگاه علوم‌پزشکی اراک، اراک، ایران. ، alikoluvand@arakmu.ac.ir
متن کامل [PDF 4505 kb]
(1304 دریافت)
| چکیده (HTML) (3306 مشاهده)
ارزیابی اثر غلظت نفت و pH
باکتری جداشده از نظر رشد و میزان تجزیه نفت در pHهای مختلف (5، 6، 7، 8، 9) مورد بررسی قرار گرفت. در این تست، باکتری در محیط بوشنل هاس دارای یک درصد نفت که pH آن توسط HCl 1N و 1N NaOH، تنظیم شده بود، به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سلسیوس کشت داده شدند. پس از این مدت، رشد باکتری از لحاظ ایجاد کدورت و میزان حذف نفت ارزیابی شد. به منظور ارزیابی میزان رشد و حذف نفت توسط سویه جداشده در غلظت‌های مختلف نفت، باکتری در محیط بوشنل هاس براث حاوی غلظت‌های 1 تا 5 درصد نفت با pH برابر با 7 تلقیح شد. پس از 7 روز انکوباسیون در دمای 30 درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه، رشد باکتری از طریق خواندن جذب نوری و میزان تجزیه نفت تعیین شد. در کلیه آزمایشات محیط بدون تلقیح باکتری به عنوان تست شاهد استفاده شد و کلیه نتایج ارائه‌شده به نسبت نمونه‌های شاهد محاسبه شده است.
سنجش حذف نفت خام به روش گاز کروماتوگرافی
پس از دوره انکوباسیون، محیط کشت به قیف جداکننده جهت جداسازی فاز آلی از فاز آبی منتقل شد. سپس فاز آلی که حاوی نفت حل‌شده در دی‌کلرو متان بود، درون ارلن ریخته شد و سه گرم سولفات سدیم جهت جذب آب باقی‌مانده به ارلن اضافه شد و به مدت یک شب در دمای اتاق نگهداری شد. سپس محتویات ارلن از کاغذ واتمن شماره یک عبور داده شد و در دمای محیط جهت تبخیر دی‌کلرو متان قرار گرفت. پس از تبخیر دی‌کلرو متان ، مجدداً سه میکرولیتر دی‌کلرو متان به یک میکرولیتر نفت باقی‌مانده اضافه شد و توسط دستگاه GC مورد آنالیز قرار گرفت. شرایط دمایی و بهره‌برداری از دستگاه GC در مقالات قبلی [22 ،21] به تفصیل توضیح داده شده است.
یافته‌ها
تصویر شماره 1 و 2 بخشی از مراحل کشت جهت جداسازی گونه باکتری را از لجن نفتی نشان می‌دهد. در این مطالعه هیچ گونه قارچی از لجن نفتی مربوطه شناسایی نشد. نتایج حاصل از میزان رشد و حذف نفت توسط سویه جداشده در pHهای مختلف (5، 6، 7، 8، 9) پس از هفت روز انکوباسیون در دمای 30درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه در تصویر شماره 3 نشان داده شده است. نتایج حاصل از میزان رشد و حذف نفت توسط سویه جداشده در غلظت‌های 1 تا 5 درصد نفت با pH برابر هفت، پس از هفت روز انکوباسیون در دمای30 درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه در تصویر شماره 4نشان داده شده است.
بحث
مشخصات سویه جداشده برای حذف نفت خام توسط تحلیل توالی ژن 16S rRNA تعیین شد. جست‌وجوی تشابه در بانک ژن NCBI نشان داد که باکتری جداسازی‌شده Acinetobacter radioresistens strain KA2 است. عدد دسترسی ژن 16SrRNA بانک ژن NCBI گزارش شده در این مقاله، برای باکتری جداشده MK127544 است. قابلیت این سویه در تجزیه بیولوژیکی نفت خام نشان داد میزان کدورت باکتری جداشده (OD 600) در زمان‌های 2، 4، 7 و 10 و 12 روز بعد از انکوباسیون به ترتیب برابر با 29/0، 86/0، 52/1، 55/1 و 25/1 بود. بنابراین فاز رشد لگاریتمی گونه جداشده در فاصله زمانی 7 تا 10 روز اتفاق می‌افتد. به همین دلیل دوره انکوباسیون آزمایشات تجزیه نفت برابر با هفت روز انتخاب شد. نتایج نشان داده شده در تصویر شماره 3 نشان می‌دهد که باکتری جداسازی‌شده قابلیت رشد و تجزیه نفت خام در غلظت اولیه یک تا پنج درصد را دارد. بنابراین، باکتری جداشده می‌تواند هیدروکربن نفتی را به عنوان منبع مجزای کربن استفاده کند. توانایی جنس Acinetobacter در تجزیه ترکیبات نفتی در چندین مقاله گزارش شده است [24 ،23 ،15].
E24 برای بررسی قابلیت سویه در تولید بیوسورفکتانت نیز محاسبه شد. سویه جداشده در این تحقیق دارای شاخص امولسیون‌سازی 14/59 درصد بود. کای و همکاران [25] نیز گزارش کردند که سویه Acinetobacter قابلیت امولسیون‌سازی بالایی (5/62) برای هگزادکان دارد. به دلیل اینکه بیوسورفکتانت کشش سطحی را بین فاز‌های مایع و جامد کاهش داده و میزان امولسیون‌سازی را افزایش می‌دهد، جذب درون‌سلولی و تجزیه هیدروکربن‌های نفتی بهبود می‌یابد. مقدار BATH نیز برای ارزیابی تمایل باکتری به هیدروکربن‌های نفتی تعیین شد. این مقدار برای سویه جداشده 69/13 درصد به دست آمد. بنابراین تمایل باکتری برای چسبیدن به ترکیبات نفتی منجر به بهبود تجزیه هیدروکربن‌های نفتی می‌شود.
از آنجایی که pH اولیه لجن نفتی برابر با 10/6 بود و pH محیط کشت، عامل مهمی در متابولیسم باکتری و حلّالیت هیدروکربن‌های نفتی است، بنابراین میزان رشد و تجزیه نفت در pHهای مختلف (5، 6، 7، 8، 9) توسط باکتری جداشده مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه، باکتری جداسازی‌شده قابلیت تجزیه نفت خام و رشد در مقادیر pH در محدوده 6 الی 8 را از خود نشان داد (تصویر شماره 4). همان‌طور که در این شکل مشاهده می‌شود، بالاترین تجزیه نفت خام به ترتیب در مقادیر pH معادل 7 ، 6 و 8 معادل با 24/62 ، 13/61 و 41/59 درصد بود. میزان حذف نفت خام و رشد باکتری به طور قابل توجهی در مقادیر pH معادل 5 و 9 کاهش یافت. این نتایج مطابق با یافته‌های مونگچیندا و همکاران [5] و همچنین وانگ و همکاران [26] بود که در حالت کلی، باکتری‌ها مقادیر pH خنثی را برای رشد و تخریب هیدروکربن‌های نفتی ترجیح می‌دهند.
تصویر شماره 4 نشان می‌دهد گونه جداسازی‌شده قادر به تخریب نفت خام در محیط مایع در غلظت‌های معادل یک الی پنج درصد است. پس از هفت روز به ترتیب 24/65، 14/76، 81/53، 84/31 و 21/25 درصد از غلظت‌های 1، 2، 3، 4 و 5 درصد نفت خام حذف شد. بنابراین، تجزیه هیدروکربن‌های نفتی تحت تأثیر غلظت اولیه‌ی آن قرار دارد؛ به طوری که غلظت‌های بالای نفت خام منجر به کاهش میزان تجزیه می‌شود.
در مطالعه حاضر مشاهده شد که سطح اولیه نفت خام معادل 2 درصد مناسب‌ترین غلظت برای رشد باکتری است تا هیدروکربن‌های نفتی را به طور کارآمدی مصرف کند. از طرف دیگر، باکتری جداسازی‌شده در سطح بسیار پایین (یک درصد) نفت خام، رشد کمتری داشت و نفت خام را نیز به میزان کمتری تجزیه کرد. وارجانی و یوپاسانی [27] نیز گزارش کردند که غلظت‌های بسیار پایین نفت خام می‌تواند تجزیه زیستی را محدود کند، زیرا منبع کربنی که از رشد جمعیت میکروبی حمایت می‌کند، ممکن است بسیار اندک باشد. در غلظت‌های بسیار بالا (4 و 5 درصد) هم میزان رشد و تجزیه نفت کاهش یافت که به علت سمیت هیدروکربن‌های نفتی بود. آوشتی و همکاران [28] نیز گزارش کردند که در غلظت پنج درصد نفت میزان حذف بسیار کاهش یافت. در این تحقیق، چنین نتیجه‌گیری شد که مقادیر بهینه غلظت نفت خام برای پشتیبانی از رشد باکتری و حذف آلاینده معادل 2 الی 3 درصد است. این غلظت از نفت خام معادل با TPH برابر با 20 تا 30کیلوگرم بر گرم است. بنابراین میتوان در فرایندهای مقیاس بزرگی همچون فرایند کمپوست با تنظیم میزان اختلاط لجن نفتی با کمپوست به این غلظت مطلوب رسید و به طور عملی و کاربردی در مقیاس کامل تصفیه لجن‌های نفتی را انجام داد. گزارشات متعددی در خصوص موفقیت‌آمیزبودن تصفیه و اصلاح زیستی لجن‌های نفتی در مقیاس کامل و با استفاده از باکتری‌های بومی جداسازی‌شده وجود دارد.
و همکاران [29] در سال 2019 توانایی گونه جداسازی حاضر را در ترکیب با گونه Sphingomonas olei strain KA1 در تصفیه غلظت‌های بالای لجن نفتی در فرایند کمپوست گزارش کردند. بر اساس نتایج مشخص شد که ترکیب این دو گونه به عنوان کنسرسیوم میکروبی قادر بود میزان TPH در گستره 10 تا 50 کیلوگرم بر گرم را در محدوده 24/94-14/60 درصد کاهش دهد. ماتسوی و همکاران نیز در سال 2014 تجزیه بیولوژیکی آلکان‌های با زنجیره بلند را از لجن‌های نفتی انجام دادند و چنین گزارش کردند که باکتری‌های گوردینا، سودوموناس و استینوباکتر نقش اصلی را در تجزیه داشتند [30].
نتیجه‌گیری
با توجه به نتایج این تحقیق، لجن‌های نفتی موجود در صنایع نفت و پتروشیمی را میتوان با فرایند تجزیه زیستی به عنوان یک گزینه اقتصادی و سازگار با محیط زیست با استفاده از گونه Acinetobacter radioresistens strain KA2 به طور کارآمدی تصفیه کرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه با کد 19250587962001 در کمیته پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه به ثبت رسیده است.
حامی مالی
این مقاله حاصل بخشی از پایان‌نامه آقای محمدسعید پورسلیمان با عنوان «بررسی کارایی فرایند کمپوست دو‌مرحله‌ای در زیست‌پالایی لجن‌های نفتی توسط باکتری بومی جداشده از لجن نفتی» در مقطع دکترا بوده است که با حمایت مالی دانشگاه دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه اجرا شد.
مشارکت نویسندگان
تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع و نگارش پیش‌نویس: محمد سعید پورسلیمان؛ سید احمد حسینی: مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبارسنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته و بصری‌سازی، نظارت؛ مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبار سنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته، بصری سازی، نظارت: سید احمد حسینی و علیرضا اطمینان؛ مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبارسنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته، بصری‌سازی، نظارت: حمید ابطحی؛ مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبارسنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته، بصری‌سازی، نظارت: علی .
تعارض منافع
بدین‌وسیله نویسندگان تصریح می‌کنند که هیچ‌گونه تضاد منافعی در خصوص این پژوهش حاضر وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از کلیه کارکنان و پرسنل محترم دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی اراک و دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه که برای انجام این تحقیق کمک کردند کمال تشکر و قدردانی را داریم.
متن کامل: (1748 مشاهده)
مقدمه
در بسیاری از جوامع امروزی آلودگی زیست‌محیطی به یکی از چالش‌های مهم و نگران‌کننده تبدیل شده است. انسان در اثر فعالیت‌های روزمره خود مقادیر قابل توجهی از آلاینده‌ها را به منابع خاک و آب وارد می‌کند که باعث ایجاد تغییرات قابل ملاحظه و مشهود در محیط زیست می‌شود. یک دسته از این آلاینده‌ها، فراورده‌های نفتی است که برخی از آن‌ها دوام بالایی دارند [2 ،1]. ورود این ترکیبات به طبیعت به سبب سمی‌بودن و ایجاد جهش و سرطان‌زایی برای موجودات زنده، از مهم‌ترین نگرانی‌های محیط زیستی است [4 ،3]. این دسته از آلاینده‌های آلی پایداری زیادی در محیط زیست دارند و انباشته‌شدن تدریجی آن‌ها موجب اختلال در کارکرد طبیعی اکوسیستم‌های آبی و خاکی می‌شود. بنابراین نیاز به تصفیه محیط‌های آلوده، برای رفع آلودگی‌های مربوطه کاملاً ضروری است [6 ،5].
فناوری‌های فیزیکی و شیمیایی مختلفی همچون تصفیه حرارتی، تثبیت و سوزاندن جهت حذف این نوع از آلودگی از مناطق با وسعت نسبتاً کم کاربرد دارند. با این حال، این روش‌ها برای حذف آلودگی‌های گسترده، صرفه اقتصادی ندارند [7-9]. در نتیجه نیاز به روش‌های دیگری همچون زیست‌پالایی کاملاً محسوس است. زیست‌پالایی محیط‌های آلوده به مواد نفتی از جمله روش‌های کارآمد در زمینه پاک‌سازی محیط‌های آلوده به مواد نفتی و کاهش آلودگی‌های محیط زیست است. راندمان بالا، سازگاری با محیط زیست و اقتصادی‌بودن از جمله مزایای روش‌های زیست‌پالایی است [10 ،6]. بنابراین در سالیان اخیر تحقیقات مختلفی در خصوص زیست‌پالایی ترکیبات نفتی انجام شده است که از مهم‌ترین آن‌ها میتوان به مطالعات وارجانی [1]، ژانگ و همکاران [3] و ژائو و همکاران [11] اشاره کرد.
با توجه به مقاومت متفاوت ترکیبات نفت خام نسبت به تجزیه زیستی، جداسازی و غربالگری سویه‌های میکروبی مقاوم و پربازده کاملاً ضروری است. اگر سویه منتخب قادر به مصرف و تجزیه ترکیبات نفتی باشد، هیدروکربن‌های نفتی به عنوان منبع کربن و انرژی، به همراه مواد غذایی معدنی مورد نیاز سلول مورد استفاده قرار می‌گیرد تا توده زیستی خود را تشکیل دهد. به این ترتیب در عین حال که میکروب رشد می‌کند، به‌تدریج آلودگی نیز از محیط حذف می‌شود [11 ،6]. میکروارگانیسم‌هایی که در محیط‌های آلوده به مواد نفتی به سر می‌برند، قابلیت بیشتری در تجزیه هیدروکربن‌ها دارند و بنابراین برای حذف آلودگی نفتی، انتخاب میکروارگانیسم‌ها از محیط‌های طبیعی که قابلیت آنزیمی بیشتری از میکروارگانیسم‌های دیگر دارند بسیار مقرون‌به‌صرفهاست [12 ،5].
هیدروکربن‌های نفتی می‌توانند توسط میکروارگانیسم‌های مختلفی تجزیه شوند که از این میان باکتری‌ها و قارچ‌ها فعال‌ترین عوامل تجزیه‌کننده نفت و نیز آغازگر فرایند تجزیه نفت معرفی شده‌اند. نوع، درصد و تنوع قارچ‌ها و باکتری‌ها در محیط‌های آب و خاک متفاوت است و در محیط‌های متفاوت و شرایط و فصول مختلف، گونه‌های مختلفی را میتوان مشاهده کرد. مطالعات مختلف نشان داده‌اند که باکتری‌های تجزیه‌کننده مواد نفتی شامل باسیلوس، آرتروباکتر، آلکالیژنز، استینوباکتر، اکرومولاکتر، کورینه باکتریوم، کلستریدیوم، سیتروباکتر، فلاووباکتریوم، اشرشیا، انتروباکتر، دسولفوویبریو، متانوباکتریوم، سودوموناس، نوکاردیا و تیوباسیلوس است که در این میان استنوباکترها از فراوان‌ترین و مقاوم‌ترین باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت به شمار می‌آیند. بنابراین استفاده از میکروارگانیسم‌های بومی دارای قابلیت بالا در زیست‌پالایی نفت خامِ سازگارِ با شرایطِ محیطیِ موجود، می‌تواند یک روش مناسب در حذف ترکیبات نفتی از مکان مورد‌نظر باشد [16-13 ،1].
با توجه به نفت‌خیز‌بودن ایران و لزوم زیست‌پالایی ترکیبات نفتی تخلیه‌شده به محیط زیست، مطالعه حاضر با هدف جداسازی، شناسایی و تعیین پتانسیل تجزیه نفت توسط گونه باکتریایی بومی (Acinetobacter radioresistens strain KA2) لجن نفتی انجام شد.
مواد و روش‌ها
جداسازی باکتری‌ها
نمونه لجن نفتی مورد استفاده در این تحقیق از بخش فرایندی پالایشگاه نفت امام خمینی (ره) شازند به صورت تصادفی تهیه شد. میزان رطوبت وpHلجن مربوطه به ترتیب برابر 63/27 درصد و 10/6 بود. برای جداسازی و غربالگری باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت از محیط کشت اختصاصی بوشنل هاس استفاده شد. در ابتدا 327/0 گرم از محیط به 100 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه و پس از اتوکلاو، سیکلوهگزامید با غلظت 500 میلی‌گرم بر لیتر جهت ممانعت از رشد قارچ اضافه شد. محیط‌های کشت بدون سیکلوهگزامید هم تهیه شد تا بتوان گونه‌های قارچی بومی را نیز جدا کرد. سپس از نمونه‌های لجن نفتی به میزان پنج گرم به داخل هرکدام از این محیط‌ها جهت غنی‌سازی اولیه تلقیح شد و به مدت یک هفته در انکوباتور شِیکردار با 160 دور در دقیقه و دمای 30 درجه سلسیوس قرار داده شد. پس از گذشت یک هفته میزان پنج میلی‌لیتر برداشت و به محیط‌های جدید که مشابه قبل تهیه شده بودند، اما دارای یک درصد نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بودند، تلقیح شد. همچنین پس از یک هفته انکوباسیون، مجدداً نمونه‌ها در محیط جدید پاساژ داده شدند. این روند تا سه مرحله تکرار شد تا کدورت به‌دست‌آمده ناشی از رشد باکتری‌ها باشد و آلودگی ترکیبات دیگر در نمونه کاهش یابد. از پاساژ نهایی، میزان 100 میکرولیتر بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار، کشت خطی داده شد و پلیت‌ها به مدت 48 ساعت در انکوباتور در دمای30 درجه سلسیوس قرار داده شدند. درنهایت برای خالص‌سازی، از هر کلنی متفاوت، یک کشت ایزوله خطی بر روی مولر هینتون آگار و به صورت جداگانه تهیه شد.
سپس برای تأیید توانایی میکروارگانیسم‌های جداشده جهت تجزیه نفت، مجدداً هرکدام از میکروارگانیسم‌ها در محیط بوشنل هاس آگار حاوی یک درصد نفت خام، به مدت یک هفته کشت داده شدند. درنهایت 24 باکتری از نمونه‌های رشد‌یافته به محیط بوشنل هاس براث واجد یک درصد نفت، جدا و تلقیح شدند که به مدت یک هفته در انکوباتور شیکردار قرار گرفتند. بعد از این مدت، چگالی نوری (OD) هرکدام از محیط‌ها در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد. سویه‌ای که بیشترین چگالی نوری و قابلیت تجزیه نفت را داشت برای ادامه تحقیق، مورد استفاده قرار گرفت.
شناسایی باکتری جداشده
برای شناسایی باکتری جداشده از آزمایش‌های اولیه رنگ‌آمیزی گرم، مورفولوژی کلنی، حرکت، اکسیداز، کاتالاز، احیای نیترات، سیترات، اوره، تولید H2S، تولید اندول و تست TSI استفاده شد. پس از آن، جهت جداسازی DNA باکتری، در ابتدا باکتری در محیط نوترینت براث در دمای30 درجه سلسیوس و 160دقیقه در دور، به مدت 24 ساعت آنکوبه شد. سپس یک میلی‌لیتر از محیط‌های کشت واجد باکتری در میکروتیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری ریخته شد و با 14 هزاردور در دقیقه به مدت دو دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی دور ریخته و رسوب نگهداری شد. با توجه به اینکه هدف، شناسایی مولکولی باکتری، با استفاده از توالی 16s rRNA بود، نمونه DNA استخراج‌شده از این باکتری جهت PCR به کار رفت. برای انجام فرایند PCR از محصولات شرکت سیناژن استفاده شد. پرایمرها به سفارش شرکت سیناژن برای شناسایی ژن 16s rRNA تهیه شد که خصوصیات آن در جدول شماره 1 آورده شده است.
پس از این مراحل، میکروتیوبها درون دستگاه PCR قرار دادهشدند و به دستگاه برنامه مورد‌نظر داده شد. برنامه مورد استفاده در این بررسی به این صورت بود: دمای 94 درجه سلسیوس، به مدت پنج دقیقه (جهت دناتوره)، دمای 94 درجه سلسیوس، به مدت یک دقیقه (جهت بازشدن دو رشته DNA)، دمای53 درجه سلسیوس، به مدت یک دقیقه (اتصال پرایمرها)، دمای 72 درجه سلسیوس، به مدت یک دقیقه (پلیمریزه‌شدن توسط آنزیم)، 35 بار تکرار سیکل از مرحله دو تا چهار و درنهایت دمای72 درجه سلسیوس، به مدت پنج دقیقه تا تمام رشته ها کامل شوند. محصول PCR درنهایت در ژل اگارز 8/0 درصد بار‌گذاری شد و در زیر نور UV، توالی حاصل با توالی‌های مارکر مقایسه شد. به دلیل وجود باندهای اضافی در کنار باند مورد‌نظر، در مرحله بعدی، محصول PCR با استفاده از کیت، خالص‌سازی شد. خالص‌سازی محصول PCR با استفاده از کیت تخلیص محصول PCR شرکت سیگما الدریچ انجام گرفت. نمونه خالص‌شده جهت تعیین توالی به شرکت ژن فناوران فرستاده شد. نتایج حاصل از تعیین توالی در بانک ژنی بلاست شده و همولوژی آن بررسی شد و قرابت‌های بالاتر از 98 درصد به عنوان جنس و گونه باکتری‌های جداسازی شده، انتخاب شدند [17].
بررسی میزان رشد باکتری شناسایی‌شده
در این مرحله نمونه ایزوله‌شده در محیط نوترنیت براث کشت داده شد و در غلظت 5/0 مک‌فارلند، در محیط بوشنل هاس دارای یک درصد نفت کشت داده شد. سپس به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه آنکوبه شد و میزان کدورت با قرائت جذب نوری در زمان‌های 2، 4، 7 و 10 و 12 روز بعد از انکوباسیون، بررسی شد. این تست، سه بار تکرار شد و میانگین جذب نوری در زمان‌های مورد بررسی، محاسبه شد. سپس باکتری به صورت کشت خالص در محیط نوترنیت براث با غلظت نهایی 5/0 مک فارلند (1/5 × 108 CFU/mL) تهیه شد و برای بررسی‌های بعدی مورد استفاده قرار گرفت.
شاخص امولسیون‌کنندگی
باکتری جداسازی‌شده ابتدا در محیط نوترینت براث در دمای 30درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه، به مدت 48 ساعت کشت داده شد. پس از این مدت، به چهار میلی‌لیتر از محیط کشت واجد باکتری رشد‌یافته، شش میلی‌لیتر نفت سفید استریل اضافه شد و ترکیب حاصل به مدت دو دقیقه با سرعت بالا با ورتکس مخلوط شد. سپس به مدت 24 ساعت به صورت ساکن در دمای محیط قرار داده شدند و پس از آن فعالیت امولسیون‌کنندگی با فرمول شماره 1 به دست آمد [19 ،18].
در بسیاری از جوامع امروزی آلودگی زیست‌محیطی به یکی از چالش‌های مهم و نگران‌کننده تبدیل شده است. انسان در اثر فعالیت‌های روزمره خود مقادیر قابل توجهی از آلاینده‌ها را به منابع خاک و آب وارد می‌کند که باعث ایجاد تغییرات قابل ملاحظه و مشهود در محیط زیست می‌شود. یک دسته از این آلاینده‌ها، فراورده‌های نفتی است که برخی از آن‌ها دوام بالایی دارند [2 ،1]. ورود این ترکیبات به طبیعت به سبب سمی‌بودن و ایجاد جهش و سرطان‌زایی برای موجودات زنده، از مهم‌ترین نگرانی‌های محیط زیستی است [4 ،3]. این دسته از آلاینده‌های آلی پایداری زیادی در محیط زیست دارند و انباشته‌شدن تدریجی آن‌ها موجب اختلال در کارکرد طبیعی اکوسیستم‌های آبی و خاکی می‌شود. بنابراین نیاز به تصفیه محیط‌های آلوده، برای رفع آلودگی‌های مربوطه کاملاً ضروری است [6 ،5].
فناوری‌های فیزیکی و شیمیایی مختلفی همچون تصفیه حرارتی، تثبیت و سوزاندن جهت حذف این نوع از آلودگی از مناطق با وسعت نسبتاً کم کاربرد دارند. با این حال، این روش‌ها برای حذف آلودگی‌های گسترده، صرفه اقتصادی ندارند [7-9]. در نتیجه نیاز به روش‌های دیگری همچون زیست‌پالایی کاملاً محسوس است. زیست‌پالایی محیط‌های آلوده به مواد نفتی از جمله روش‌های کارآمد در زمینه پاک‌سازی محیط‌های آلوده به مواد نفتی و کاهش آلودگی‌های محیط زیست است. راندمان بالا، سازگاری با محیط زیست و اقتصادی‌بودن از جمله مزایای روش‌های زیست‌پالایی است [10 ،6]. بنابراین در سالیان اخیر تحقیقات مختلفی در خصوص زیست‌پالایی ترکیبات نفتی انجام شده است که از مهم‌ترین آن‌ها میتوان به مطالعات وارجانی [1]، ژانگ و همکاران [3] و ژائو و همکاران [11] اشاره کرد.
با توجه به مقاومت متفاوت ترکیبات نفت خام نسبت به تجزیه زیستی، جداسازی و غربالگری سویه‌های میکروبی مقاوم و پربازده کاملاً ضروری است. اگر سویه منتخب قادر به مصرف و تجزیه ترکیبات نفتی باشد، هیدروکربن‌های نفتی به عنوان منبع کربن و انرژی، به همراه مواد غذایی معدنی مورد نیاز سلول مورد استفاده قرار می‌گیرد تا توده زیستی خود را تشکیل دهد. به این ترتیب در عین حال که میکروب رشد می‌کند، به‌تدریج آلودگی نیز از محیط حذف می‌شود [11 ،6]. میکروارگانیسم‌هایی که در محیط‌های آلوده به مواد نفتی به سر می‌برند، قابلیت بیشتری در تجزیه هیدروکربن‌ها دارند و بنابراین برای حذف آلودگی نفتی، انتخاب میکروارگانیسم‌ها از محیط‌های طبیعی که قابلیت آنزیمی بیشتری از میکروارگانیسم‌های دیگر دارند بسیار مقرون‌به‌صرفهاست [12 ،5].
هیدروکربن‌های نفتی می‌توانند توسط میکروارگانیسم‌های مختلفی تجزیه شوند که از این میان باکتری‌ها و قارچ‌ها فعال‌ترین عوامل تجزیه‌کننده نفت و نیز آغازگر فرایند تجزیه نفت معرفی شده‌اند. نوع، درصد و تنوع قارچ‌ها و باکتری‌ها در محیط‌های آب و خاک متفاوت است و در محیط‌های متفاوت و شرایط و فصول مختلف، گونه‌های مختلفی را میتوان مشاهده کرد. مطالعات مختلف نشان داده‌اند که باکتری‌های تجزیه‌کننده مواد نفتی شامل باسیلوس، آرتروباکتر، آلکالیژنز، استینوباکتر، اکرومولاکتر، کورینه باکتریوم، کلستریدیوم، سیتروباکتر، فلاووباکتریوم، اشرشیا، انتروباکتر، دسولفوویبریو، متانوباکتریوم، سودوموناس، نوکاردیا و تیوباسیلوس است که در این میان استنوباکترها از فراوان‌ترین و مقاوم‌ترین باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت به شمار می‌آیند. بنابراین استفاده از میکروارگانیسم‌های بومی دارای قابلیت بالا در زیست‌پالایی نفت خامِ سازگارِ با شرایطِ محیطیِ موجود، می‌تواند یک روش مناسب در حذف ترکیبات نفتی از مکان مورد‌نظر باشد [16-13 ،1].
با توجه به نفت‌خیز‌بودن ایران و لزوم زیست‌پالایی ترکیبات نفتی تخلیه‌شده به محیط زیست، مطالعه حاضر با هدف جداسازی، شناسایی و تعیین پتانسیل تجزیه نفت توسط گونه باکتریایی بومی (Acinetobacter radioresistens strain KA2) لجن نفتی انجام شد.
مواد و روش‌ها
جداسازی باکتری‌ها
نمونه لجن نفتی مورد استفاده در این تحقیق از بخش فرایندی پالایشگاه نفت امام خمینی (ره) شازند به صورت تصادفی تهیه شد. میزان رطوبت وpHلجن مربوطه به ترتیب برابر 63/27 درصد و 10/6 بود. برای جداسازی و غربالگری باکتری‌های تجزیه‌کننده نفت از محیط کشت اختصاصی بوشنل هاس استفاده شد. در ابتدا 327/0 گرم از محیط به 100 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه و پس از اتوکلاو، سیکلوهگزامید با غلظت 500 میلی‌گرم بر لیتر جهت ممانعت از رشد قارچ اضافه شد. محیط‌های کشت بدون سیکلوهگزامید هم تهیه شد تا بتوان گونه‌های قارچی بومی را نیز جدا کرد. سپس از نمونه‌های لجن نفتی به میزان پنج گرم به داخل هرکدام از این محیط‌ها جهت غنی‌سازی اولیه تلقیح شد و به مدت یک هفته در انکوباتور شِیکردار با 160 دور در دقیقه و دمای 30 درجه سلسیوس قرار داده شد. پس از گذشت یک هفته میزان پنج میلی‌لیتر برداشت و به محیط‌های جدید که مشابه قبل تهیه شده بودند، اما دارای یک درصد نفت خام استریل به عنوان منبع کربن بودند، تلقیح شد. همچنین پس از یک هفته انکوباسیون، مجدداً نمونه‌ها در محیط جدید پاساژ داده شدند. این روند تا سه مرحله تکرار شد تا کدورت به‌دست‌آمده ناشی از رشد باکتری‌ها باشد و آلودگی ترکیبات دیگر در نمونه کاهش یابد. از پاساژ نهایی، میزان 100 میکرولیتر بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار، کشت خطی داده شد و پلیت‌ها به مدت 48 ساعت در انکوباتور در دمای30 درجه سلسیوس قرار داده شدند. درنهایت برای خالص‌سازی، از هر کلنی متفاوت، یک کشت ایزوله خطی بر روی مولر هینتون آگار و به صورت جداگانه تهیه شد.
سپس برای تأیید توانایی میکروارگانیسم‌های جداشده جهت تجزیه نفت، مجدداً هرکدام از میکروارگانیسم‌ها در محیط بوشنل هاس آگار حاوی یک درصد نفت خام، به مدت یک هفته کشت داده شدند. درنهایت 24 باکتری از نمونه‌های رشد‌یافته به محیط بوشنل هاس براث واجد یک درصد نفت، جدا و تلقیح شدند که به مدت یک هفته در انکوباتور شیکردار قرار گرفتند. بعد از این مدت، چگالی نوری (OD) هرکدام از محیط‌ها در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد. سویه‌ای که بیشترین چگالی نوری و قابلیت تجزیه نفت را داشت برای ادامه تحقیق، مورد استفاده قرار گرفت.
شناسایی باکتری جداشده
برای شناسایی باکتری جداشده از آزمایش‌های اولیه رنگ‌آمیزی گرم، مورفولوژی کلنی، حرکت، اکسیداز، کاتالاز، احیای نیترات، سیترات، اوره، تولید H2S، تولید اندول و تست TSI استفاده شد. پس از آن، جهت جداسازی DNA باکتری، در ابتدا باکتری در محیط نوترینت براث در دمای30 درجه سلسیوس و 160دقیقه در دور، به مدت 24 ساعت آنکوبه شد. سپس یک میلی‌لیتر از محیط‌های کشت واجد باکتری در میکروتیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری ریخته شد و با 14 هزاردور در دقیقه به مدت دو دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی دور ریخته و رسوب نگهداری شد. با توجه به اینکه هدف، شناسایی مولکولی باکتری، با استفاده از توالی 16s rRNA بود، نمونه DNA استخراج‌شده از این باکتری جهت PCR به کار رفت. برای انجام فرایند PCR از محصولات شرکت سیناژن استفاده شد. پرایمرها به سفارش شرکت سیناژن برای شناسایی ژن 16s rRNA تهیه شد که خصوصیات آن در جدول شماره 1 آورده شده است.
پس از این مراحل، میکروتیوبها درون دستگاه PCR قرار دادهشدند و به دستگاه برنامه مورد‌نظر داده شد. برنامه مورد استفاده در این بررسی به این صورت بود: دمای 94 درجه سلسیوس، به مدت پنج دقیقه (جهت دناتوره)، دمای 94 درجه سلسیوس، به مدت یک دقیقه (جهت بازشدن دو رشته DNA)، دمای53 درجه سلسیوس، به مدت یک دقیقه (اتصال پرایمرها)، دمای 72 درجه سلسیوس، به مدت یک دقیقه (پلیمریزه‌شدن توسط آنزیم)، 35 بار تکرار سیکل از مرحله دو تا چهار و درنهایت دمای72 درجه سلسیوس، به مدت پنج دقیقه تا تمام رشته ها کامل شوند. محصول PCR درنهایت در ژل اگارز 8/0 درصد بار‌گذاری شد و در زیر نور UV، توالی حاصل با توالی‌های مارکر مقایسه شد. به دلیل وجود باندهای اضافی در کنار باند مورد‌نظر، در مرحله بعدی، محصول PCR با استفاده از کیت، خالص‌سازی شد. خالص‌سازی محصول PCR با استفاده از کیت تخلیص محصول PCR شرکت سیگما الدریچ انجام گرفت. نمونه خالص‌شده جهت تعیین توالی به شرکت ژن فناوران فرستاده شد. نتایج حاصل از تعیین توالی در بانک ژنی بلاست شده و همولوژی آن بررسی شد و قرابت‌های بالاتر از 98 درصد به عنوان جنس و گونه باکتری‌های جداسازی شده، انتخاب شدند [17].
بررسی میزان رشد باکتری شناسایی‌شده
در این مرحله نمونه ایزوله‌شده در محیط نوترنیت براث کشت داده شد و در غلظت 5/0 مک‌فارلند، در محیط بوشنل هاس دارای یک درصد نفت کشت داده شد. سپس به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه آنکوبه شد و میزان کدورت با قرائت جذب نوری در زمان‌های 2، 4، 7 و 10 و 12 روز بعد از انکوباسیون، بررسی شد. این تست، سه بار تکرار شد و میانگین جذب نوری در زمان‌های مورد بررسی، محاسبه شد. سپس باکتری به صورت کشت خالص در محیط نوترنیت براث با غلظت نهایی 5/0 مک فارلند (1/5 × 108 CFU/mL) تهیه شد و برای بررسی‌های بعدی مورد استفاده قرار گرفت.
شاخص امولسیون‌کنندگی
باکتری جداسازی‌شده ابتدا در محیط نوترینت براث در دمای 30درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه، به مدت 48 ساعت کشت داده شد. پس از این مدت، به چهار میلی‌لیتر از محیط کشت واجد باکتری رشد‌یافته، شش میلی‌لیتر نفت سفید استریل اضافه شد و ترکیب حاصل به مدت دو دقیقه با سرعت بالا با ورتکس مخلوط شد. سپس به مدت 24 ساعت به صورت ساکن در دمای محیط قرار داده شدند و پس از آن فعالیت امولسیون‌کنندگی با فرمول شماره 1 به دست آمد [19 ،18].
سنجش چسبندگی سلولی به هیدروکربن
ابتدا باکتری ایزوله‌شده در محیط نوترینت آگار در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت کشت داده شد. سپس یک کلنی از باکتری در 9 میلی‌لیتر بافر فسفات اضافه شده و به‌شدت ورتکس شد و جذب نوری آن در حدود 3/0 تنظیم شد (OD1). سپس به نمونه 200 میکرولیتر هگزادکان اضافه و به مدت دو دقیقه ورتکس با سرعت بالا صورت گرفت و پس از آن اجازه داده شد تا فاز هیدروکربنی جدا شود. سپس کدورت فاز آبی (لایه زیری) در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد (OD2). نتایج به صورت اختلاف درصد جذب فاز آبی بعد از تیمار، نسبت به جذب اولیه سوسپانسیون باکتریایی تعیین شد. با استفاده از فرمول شماره 2 میزان BATH نمونه محاسبه شد [20].
ابتدا باکتری ایزوله‌شده در محیط نوترینت آگار در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 24 ساعت کشت داده شد. سپس یک کلنی از باکتری در 9 میلی‌لیتر بافر فسفات اضافه شده و به‌شدت ورتکس شد و جذب نوری آن در حدود 3/0 تنظیم شد (OD1). سپس به نمونه 200 میکرولیتر هگزادکان اضافه و به مدت دو دقیقه ورتکس با سرعت بالا صورت گرفت و پس از آن اجازه داده شد تا فاز هیدروکربنی جدا شود. سپس کدورت فاز آبی (لایه زیری) در طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد (OD2). نتایج به صورت اختلاف درصد جذب فاز آبی بعد از تیمار، نسبت به جذب اولیه سوسپانسیون باکتریایی تعیین شد. با استفاده از فرمول شماره 2 میزان BATH نمونه محاسبه شد [20].
ارزیابی اثر غلظت نفت و pH
باکتری جداشده از نظر رشد و میزان تجزیه نفت در pHهای مختلف (5، 6، 7، 8، 9) مورد بررسی قرار گرفت. در این تست، باکتری در محیط بوشنل هاس دارای یک درصد نفت که pH آن توسط HCl 1N و 1N NaOH، تنظیم شده بود، به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سلسیوس کشت داده شدند. پس از این مدت، رشد باکتری از لحاظ ایجاد کدورت و میزان حذف نفت ارزیابی شد. به منظور ارزیابی میزان رشد و حذف نفت توسط سویه جداشده در غلظت‌های مختلف نفت، باکتری در محیط بوشنل هاس براث حاوی غلظت‌های 1 تا 5 درصد نفت با pH برابر با 7 تلقیح شد. پس از 7 روز انکوباسیون در دمای 30 درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه، رشد باکتری از طریق خواندن جذب نوری و میزان تجزیه نفت تعیین شد. در کلیه آزمایشات محیط بدون تلقیح باکتری به عنوان تست شاهد استفاده شد و کلیه نتایج ارائه‌شده به نسبت نمونه‌های شاهد محاسبه شده است.
سنجش حذف نفت خام به روش گاز کروماتوگرافی
پس از دوره انکوباسیون، محیط کشت به قیف جداکننده جهت جداسازی فاز آلی از فاز آبی منتقل شد. سپس فاز آلی که حاوی نفت حل‌شده در دی‌کلرو متان بود، درون ارلن ریخته شد و سه گرم سولفات سدیم جهت جذب آب باقی‌مانده به ارلن اضافه شد و به مدت یک شب در دمای اتاق نگهداری شد. سپس محتویات ارلن از کاغذ واتمن شماره یک عبور داده شد و در دمای محیط جهت تبخیر دی‌کلرو متان قرار گرفت. پس از تبخیر دی‌کلرو متان ، مجدداً سه میکرولیتر دی‌کلرو متان به یک میکرولیتر نفت باقی‌مانده اضافه شد و توسط دستگاه GC مورد آنالیز قرار گرفت. شرایط دمایی و بهره‌برداری از دستگاه GC در مقالات قبلی [22 ،21] به تفصیل توضیح داده شده است.
یافته‌ها
تصویر شماره 1 و 2 بخشی از مراحل کشت جهت جداسازی گونه باکتری را از لجن نفتی نشان می‌دهد. در این مطالعه هیچ گونه قارچی از لجن نفتی مربوطه شناسایی نشد. نتایج حاصل از میزان رشد و حذف نفت توسط سویه جداشده در pHهای مختلف (5، 6، 7، 8، 9) پس از هفت روز انکوباسیون در دمای 30درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه در تصویر شماره 3 نشان داده شده است. نتایج حاصل از میزان رشد و حذف نفت توسط سویه جداشده در غلظت‌های 1 تا 5 درصد نفت با pH برابر هفت، پس از هفت روز انکوباسیون در دمای30 درجه سلسیوس و 120 دور در دقیقه در تصویر شماره 4نشان داده شده است.
بحث
مشخصات سویه جداشده برای حذف نفت خام توسط تحلیل توالی ژن 16S rRNA تعیین شد. جست‌وجوی تشابه در بانک ژن NCBI نشان داد که باکتری جداسازی‌شده Acinetobacter radioresistens strain KA2 است. عدد دسترسی ژن 16SrRNA بانک ژن NCBI گزارش شده در این مقاله، برای باکتری جداشده MK127544 است. قابلیت این سویه در تجزیه بیولوژیکی نفت خام نشان داد میزان کدورت باکتری جداشده (OD 600) در زمان‌های 2، 4، 7 و 10 و 12 روز بعد از انکوباسیون به ترتیب برابر با 29/0، 86/0، 52/1، 55/1 و 25/1 بود. بنابراین فاز رشد لگاریتمی گونه جداشده در فاصله زمانی 7 تا 10 روز اتفاق می‌افتد. به همین دلیل دوره انکوباسیون آزمایشات تجزیه نفت برابر با هفت روز انتخاب شد. نتایج نشان داده شده در تصویر شماره 3 نشان می‌دهد که باکتری جداسازی‌شده قابلیت رشد و تجزیه نفت خام در غلظت اولیه یک تا پنج درصد را دارد. بنابراین، باکتری جداشده می‌تواند هیدروکربن نفتی را به عنوان منبع مجزای کربن استفاده کند. توانایی جنس Acinetobacter در تجزیه ترکیبات نفتی در چندین مقاله گزارش شده است [24 ،23 ،15].
E24 برای بررسی قابلیت سویه در تولید بیوسورفکتانت نیز محاسبه شد. سویه جداشده در این تحقیق دارای شاخص امولسیون‌سازی 14/59 درصد بود. کای و همکاران [25] نیز گزارش کردند که سویه Acinetobacter قابلیت امولسیون‌سازی بالایی (5/62) برای هگزادکان دارد. به دلیل اینکه بیوسورفکتانت کشش سطحی را بین فاز‌های مایع و جامد کاهش داده و میزان امولسیون‌سازی را افزایش می‌دهد، جذب درون‌سلولی و تجزیه هیدروکربن‌های نفتی بهبود می‌یابد. مقدار BATH نیز برای ارزیابی تمایل باکتری به هیدروکربن‌های نفتی تعیین شد. این مقدار برای سویه جداشده 69/13 درصد به دست آمد. بنابراین تمایل باکتری برای چسبیدن به ترکیبات نفتی منجر به بهبود تجزیه هیدروکربن‌های نفتی می‌شود.
از آنجایی که pH اولیه لجن نفتی برابر با 10/6 بود و pH محیط کشت، عامل مهمی در متابولیسم باکتری و حلّالیت هیدروکربن‌های نفتی است، بنابراین میزان رشد و تجزیه نفت در pHهای مختلف (5، 6، 7، 8، 9) توسط باکتری جداشده مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه، باکتری جداسازی‌شده قابلیت تجزیه نفت خام و رشد در مقادیر pH در محدوده 6 الی 8 را از خود نشان داد (تصویر شماره 4). همان‌طور که در این شکل مشاهده می‌شود، بالاترین تجزیه نفت خام به ترتیب در مقادیر pH معادل 7 ، 6 و 8 معادل با 24/62 ، 13/61 و 41/59 درصد بود. میزان حذف نفت خام و رشد باکتری به طور قابل توجهی در مقادیر pH معادل 5 و 9 کاهش یافت. این نتایج مطابق با یافته‌های مونگچیندا و همکاران [5] و همچنین وانگ و همکاران [26] بود که در حالت کلی، باکتری‌ها مقادیر pH خنثی را برای رشد و تخریب هیدروکربن‌های نفتی ترجیح می‌دهند.
تصویر شماره 4 نشان می‌دهد گونه جداسازی‌شده قادر به تخریب نفت خام در محیط مایع در غلظت‌های معادل یک الی پنج درصد است. پس از هفت روز به ترتیب 24/65، 14/76، 81/53، 84/31 و 21/25 درصد از غلظت‌های 1، 2، 3، 4 و 5 درصد نفت خام حذف شد. بنابراین، تجزیه هیدروکربن‌های نفتی تحت تأثیر غلظت اولیه‌ی آن قرار دارد؛ به طوری که غلظت‌های بالای نفت خام منجر به کاهش میزان تجزیه می‌شود.
در مطالعه حاضر مشاهده شد که سطح اولیه نفت خام معادل 2 درصد مناسب‌ترین غلظت برای رشد باکتری است تا هیدروکربن‌های نفتی را به طور کارآمدی مصرف کند. از طرف دیگر، باکتری جداسازی‌شده در سطح بسیار پایین (یک درصد) نفت خام، رشد کمتری داشت و نفت خام را نیز به میزان کمتری تجزیه کرد. وارجانی و یوپاسانی [27] نیز گزارش کردند که غلظت‌های بسیار پایین نفت خام می‌تواند تجزیه زیستی را محدود کند، زیرا منبع کربنی که از رشد جمعیت میکروبی حمایت می‌کند، ممکن است بسیار اندک باشد. در غلظت‌های بسیار بالا (4 و 5 درصد) هم میزان رشد و تجزیه نفت کاهش یافت که به علت سمیت هیدروکربن‌های نفتی بود. آوشتی و همکاران [28] نیز گزارش کردند که در غلظت پنج درصد نفت میزان حذف بسیار کاهش یافت. در این تحقیق، چنین نتیجه‌گیری شد که مقادیر بهینه غلظت نفت خام برای پشتیبانی از رشد باکتری و حذف آلاینده معادل 2 الی 3 درصد است. این غلظت از نفت خام معادل با TPH برابر با 20 تا 30کیلوگرم بر گرم است. بنابراین میتوان در فرایندهای مقیاس بزرگی همچون فرایند کمپوست با تنظیم میزان اختلاط لجن نفتی با کمپوست به این غلظت مطلوب رسید و به طور عملی و کاربردی در مقیاس کامل تصفیه لجن‌های نفتی را انجام داد. گزارشات متعددی در خصوص موفقیت‌آمیزبودن تصفیه و اصلاح زیستی لجن‌های نفتی در مقیاس کامل و با استفاده از باکتری‌های بومی جداسازی‌شده وجود دارد.
و همکاران [29] در سال 2019 توانایی گونه جداسازی حاضر را در ترکیب با گونه Sphingomonas olei strain KA1 در تصفیه غلظت‌های بالای لجن نفتی در فرایند کمپوست گزارش کردند. بر اساس نتایج مشخص شد که ترکیب این دو گونه به عنوان کنسرسیوم میکروبی قادر بود میزان TPH در گستره 10 تا 50 کیلوگرم بر گرم را در محدوده 24/94-14/60 درصد کاهش دهد. ماتسوی و همکاران نیز در سال 2014 تجزیه بیولوژیکی آلکان‌های با زنجیره بلند را از لجن‌های نفتی انجام دادند و چنین گزارش کردند که باکتری‌های گوردینا، سودوموناس و استینوباکتر نقش اصلی را در تجزیه داشتند [30].
نتیجه‌گیری
با توجه به نتایج این تحقیق، لجن‌های نفتی موجود در صنایع نفت و پتروشیمی را میتوان با فرایند تجزیه زیستی به عنوان یک گزینه اقتصادی و سازگار با محیط زیست با استفاده از گونه Acinetobacter radioresistens strain KA2 به طور کارآمدی تصفیه کرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه با کد 19250587962001 در کمیته پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه به ثبت رسیده است.
حامی مالی
این مقاله حاصل بخشی از پایان‌نامه آقای محمدسعید پورسلیمان با عنوان «بررسی کارایی فرایند کمپوست دو‌مرحله‌ای در زیست‌پالایی لجن‌های نفتی توسط باکتری بومی جداشده از لجن نفتی» در مقطع دکترا بوده است که با حمایت مالی دانشگاه دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه اجرا شد.
مشارکت نویسندگان
تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع و نگارش پیش‌نویس: محمد سعید پورسلیمان؛ سید احمد حسینی: مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبارسنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته و بصری‌سازی، نظارت؛ مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبار سنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته، بصری سازی، نظارت: سید احمد حسینی و علیرضا اطمینان؛ مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبارسنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته، بصری‌سازی، نظارت: حمید ابطحی؛ مفهوم‌سازی، روش‌شناسی، اعتبارسنجی، تحلیل، تحقیق و بررسی، منابع، نگارش پیش‌نویس، ویراستاری و نهایی‌سازی نوشته، بصری‌سازی، نظارت: علی .
تعارض منافع
بدین‌وسیله نویسندگان تصریح می‌کنند که هیچ‌گونه تضاد منافعی در خصوص این پژوهش حاضر وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از کلیه کارکنان و پرسنل محترم دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی اراک و دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمانشاه که برای انجام این تحقیق کمک کردند کمال تشکر و قدردانی را داریم.
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
