بیماری آلزایمر یﮏ ﺑﯿﻤﺎری ﻧﻮرودژﻧﺮاﺗﯿﻮ اﺳﺖ ﮐﻪ ﺑـﺎ اﺧﺘﻼﻻت ﻋﻤﯿﻖ ﻋﻤﻠﮑﺮدهای ﺣﺎﻓﻈﻪ و ﺷـﻨﺎﺧﺘﯽ همراه است. در این بیماری، تجمع آمیلوئید با هایپرفسفریلاسیون پروتئین تائو، ایجاد استرس اکسیداتیو، التهاب، تغییر ترشح مواد میانجی، مهار پلاستیسیتی سیناپسی، کاهش تعداد و عملکرد نورون‌های کولینرژیکی و در‌نهایت مرگ سلولی موجب پیشرفت بیماری می‌شود [1]. این اختلال بر گفتار، حافظه و تفکر اثر می‌گذارد. شروع بیماری سال‌ها قبل از تخریب حافظه آغاز و باعث ناتوانی فرد در مراقبت از خویش می‌گردد. از جمله عوامل افزایش آن، بیماری‌های مزمن التهابی، رژیم غذایی فاقد آنتی‌اکسیدان و کاهش فعالیت‌های ذهنی و بدنی معرفی شده است [2]. در سال 2006 بیش از 26 میلیون نفر از این بیماری آسیب دیده بودند. پیش‌بینی‌ها نشانگر ابتلای یک نفر از هر 85 نفر در جهان تا سال 2050 است [3]. این بیماری در زنان مسن شایع‌تر از مردان است. ترکیبات استروئیدی پیش‌ساز استروژن، پروژسترون و خود آن‌ها در‌ درمان هورمونی زنان در یائسگی، بر حافظه اثر مثبت داشته‌اند. هورمون‌های استروئیدی زنان موجب بهبود تعداد سیناپس‌های عصبی، افزایش حلالیت بتا آمیلوئیدها و انجام نقش آنتی‌اکسیدانی توسط آن‌ها می‌شوند و بر حافظه اثر مثبتی دارند [2]. رادیکال‌های آزاد با تخریب بافت مغز باعث ایجاد گونه‌های فعال اکسیژن  می‌شوند و عمل میانجی‌های نورونی را مختل می‌کنند، در‌نتیجه از عوامل اصلی در آلزایمر و تخریب نورونی هستند. تجمع ROS منجر به استرس اکسیداتیو می‌شود که عامل اصلی بیماری آلزایمر گزارش شده است و به همه مولکول‌های زیستی شامل لیپیدها، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک حمله می‌کند. مغز برای خنثی کردن‌ رادیکال‌های آزاد به آنتی‌اکسیدان نیازمند است و همچنین آمیلوئید بتا به واسطه ایجاد استرس اکسیداتیو باعث افزایش آپوپتوز نورون‌ها می‌شود [3]. شواهد نشان داده است که رژیم حاوی مواد غذایی مدیترانه‌ای (سرشار از آنتی‌اکسیدان) احتمال ابتلا به آلزایمر را تا 40 درصد کاهش می‌دهد [4]. 
گیاهان دارویی در سال‌های اخیر به دلیل داشتن اثرات متنوع، برای درمان بیماری‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند. از جمله اثرات درمانی گیاهان خاصیت ضدالتهابی آن‌هاست. رژیم‌ غذایی مناسب برای جلوگیری از التهاب عروق مغزی، افزایش کلسترول و افزودن ریسک آلزایمر لازم است. تحقیقات نشان داده‌اند که استفاده از ساپونین‌های استروئیدی سبب کاهش عوامل پیش‌التهابی در مغز می‌شود. از دیگر فواید آن می‌توان به خاصیت آنتی‌اکسیدانی و آنتی‌استیل‌کولین استرازی آن‌ها اشاره کرد [5]. گیاه بذرالبنج از تیره سیب‌زمینی است. این گیاه دارای خواص ضدالتهابی و آنتی‌اکسیدانی است [6]. هیوسیاموزید یک ساپونین (گلیکوزید) استروئیدی در بذرالبنج است که 17 نوع گلیکوزید از جمله تیگوژنین، فورستان و دیوسژنین دارد. مواد غذایی با خواص آنتی‌اکسیدانی یا ضدالتهابی خود نقش مهمی در کاهش ابتلا و مهار زوال عقل دارند. از این رو اثر هیوسیاموزید بر حافظه فضایی برای نخستین‌بار مورد بررسی قرار گرفت [6]. 
علاوه بر عوامل نوروپاتولوژی، فرضیات استرس اکسیداتیو، التهاب و کولینرژیک از فرضیات ابتلا به بیماری آلزایمر هستند [7]. مغز بیماران آلزایمری دچار کمبود استیل‌کولین است. استیل‌کولین یک ناقل عصبی مهم در فرایند حافظه و یادگیری است و عقیده بر این است که نقص رفتاری و عملکردی در بیماری آلزایمر به دلیل عدم توانایی در انتقال پیام عصبی در سـیناپس‌های کولینرژیکی است. بر اساس نظریه کولینرژیک، کاهش میزان استیل‌کولین در‌نتیجه آزاد شدن بیش از اندازه استیل‌کولین استراز بر حافظه افراد مبتلا به آلزایمر تأثیر دارد [7]. فلاونوئیدها و ساپونین‌های استروئیدی با دارا بودن خاصیت مهارکنندگی استیل‌کولین استرازی و نیز خواص آنتی‌اکسیدانی، رادیکال‌های آزاد را خنثی می‌کنند و در درمان بسیاری از بیماری‌ها کاربرد دارند. کاهش میزان استیل‌کولین به علت ترشح بیش از اندازه استیل‌کولین استراز بر حافظه فضایی افراد آلزایمری مؤثر است [8]. مطالعات In vivo و In vitro از اثر نوروپروتکتیو ساپونین‌ها حمایت می‌کنند. استفاده از ساپوژنین استروئیدی باعث بهبود حافظه در مدل موش 5XFAD شد و موجب کاهش بتا آمیلوئید شد [9].
دونپزیل یک مهارکننده غیررقابتی و بازگشت‌پذیر استیل‌کولین استراز است که باعث افزایش استیل‌کولین خارج سلولی می‌شود و در کبد متابولیزه می‌شود. مهارکننده آنزیم کلیدی تشکیل آمیلوئید، بتا- سکرتاز است و مهار این آنزیم به عنوان یکی از اهداف درمانی بیماری آلزایمر مطرح است. تهوع، استفراغ، اسهال، خستگی، بی‌خوابی، گیجی، بی‌اشتهایی، کاهش وزن، اختلال کبدی و تعریق از جمله عوارض جانبی دارو هستند که استفاده از آن را برای برخی افراد محدود می‌کند [10]. این دارو علائم نشانه‌ای را بهبود می‌بخشد. بنابراین راهبردهای درمانی جدیدی برای درمان آلزایمر نیاز است و در این میان، استفاده از گیاهان دارویی با عوارض کم و خواص آنتی‌اکسیدانی، بسیار مورد توجه است. از این رو اثر ساپوژنین (هیوسیاموزید) بر حافظه فضایی مورد بررسی قرار گرفت تا شاید با توجه به عوارض کم داروی هیوسیاموزید، از این ترکیب بتوان به عنوان مکمل غذایی برای خانواده‌هایی با بیماری آلزایمر موروثی به منظور پیشگیری، تاخیر پاتولوژی و درمان بیماری استفاده کرد. 
مهارکننده‌های استیل‌کولین استراز از سلول‌ها در برابر آسیب بتا آمیلوئید و رادیکال‌های آزاد محافظت می‌کنند و مانع ترشح سیتوکین‌ها به واسطه میکروگلیاها می‌شوند یافته‌ها بر افزایش جریان خون عروق مغزی در درمان با مهارکننده‌های استیل‌کولین استراز دلالت دارند [7]. خواص آنتی‌اکسیدانی دونپزیل بر علیه رادیکال‌های آزاد به اثبات رسیده است. دونپزیل نه‌تنها میکروگلیا را در مغز سرکوب می‌کند، بلکه در موشPS19 تحریک‌شده با لیپوپلی‌ساکارید (LPS)، بیان اینترلوکین-β1 و سیکلواکسیژیناز 2 را در مغز و طحال مهار کرده و مانع از التهاب سیستمیک می‌شود. شواهد در حال حاضر نشان می‌دهند مهارکنندگان استیل‌کولین استرازها دارای نقش ضدالتهابی، اقدام علیه رادیکال‌های آزاد و سمیت آمیلوئید از طریق کاهش انتشار سیتوکین‌ها از میکروگلیا هستند [11]. 
التهاب ناشی از پلاک‌های آمیلوئیدی در بیماران آلزایمری از جمله دلایل بروز این بیماری است. تجمع بتا آمیلوئید (Aβ ) در آلزایمر با یک پاسخ التهابی ناشی از فعال شدن میکروگلیا و گرد آمدن آستروسیت‌ها همراه بوده و موجب القاء بیان سیتوکین‌های پیش‌التهابی و افزایش آسیب‌های اکسیداتیو می‌شود. به دلیل نیاز مغز به مقدار قابل توجه انرژی و اکسیژن، این بافت مستعد آسیب‌های اکسیداتیو بوده و افزایش استرس اکسیداتیو مغز در سنین بالا زمینه‌ساز ابتلا به بیماری آلزایمر است [12]. درمان با ساپوژنین‌های گیاه پلاتیکدن گراندیفلوروس (گل زنگوله‌ای چینی) پس از قرار گرفتن در معرض LPS به طور قابل توجهی بیان اینترلوکین-β1 و NF-κB (فاکتور هسته‌ای کاپا بی)، ERK (کیناز تنظیم‌شده سیگنال خارج سلولی)، JNK (کیناز N- ترمینال Jun)، همچنین MAPK (پروتئین‌کیناز فعال‌شده با میتوژن) و TNF-α (فاکتور نکروزدهنده تومور آلفا) در سلول‌های میکروگلیایی را کاهش می‌دهد. این ساپونین‌ها ممکن است با مهار پاسخ التهابی در سلول‌های میکروگلیای فعال در درمان بیماری‌های عصبی مؤثر باشند [13]. مطالعات اپیدمیولوژی نشان داده است درمان طولانی‌مدت با داروهای ضدالتهابی، خطر بروز بیماری آلزایمر را بیش از 80 درصد کاهش داده و رخداد این بیماری را به تأخیر می‌اندازد که خود تأییدی بر نقش التهاب در رخداد و پیشرفت بیماری آلزایمر است [14]. 
ساپوژنین‌ها خاصیت ضدالتهابی قوی دارند و به طور خاص سیگنالینگ NF–кB را هدف قرار می‌دهند. این ترکیب سیگنالینگ ERK ،MAPK را تعدیل می‌کند. کاهش آنزیم‌های گزانتین‌اکسیداز، سیکلواکسیژناز، ماتریکس متالوپروتئیناز و نیتریک‌اکسید سنتاز، از سازوکارهای ضدالتهابی آن‌هاست، اما مصرف در دُزهای بسیار بالا ممکن است با عوارض کبدی همراه باشد [8]. در بررسی ساپونین‌های استروئیدی جینسینگ نشان داده شده است این ترکیبات سمیت Aβ42 را در سلول‌های BV-2 با مهار TNF-α و NF-κB ،IL-β1 ،iNOS کاهش می‌دهند [9]. فلاونوئید‌ها و ساپونین‌های استروئیدی (کاردیوگلیکوزیدها) دارای خواص ضدانعقادی، ضدالتهابی، ضدعفونی، حفاظت نورونی، مهارکننده استیل‌کولین استراز، کاهش‌دهنده ‌گلوکز خروجی از کبد، کلسترول، مقاومت به انسولین، بهبوددهنده جریان خون مغز و فعالیت‌های ضدسرطانی هستند، اگرچه برخی از فلاونوئیدها با غلظت بالا در متاستاز موجب القای آپوپتوز می‌شوند [5]. 
آمیلوئید بتا باعث از دست رفتن فعالیت کولینرژیک از طریق مهار مراحل ساخت و ترشح استیل‌کولین می‌شود. تزریق مستقیم Aβ به مغز موش نشان داد که Aβ باعث کاهش تولید استیل‌کولین شده و دارای فعالیت ضدکولینرژیک است و باعث افزایش پاتولوژی آلزایمر از جمله مسیر تائو و التهاب نورونی می‌شود [3].
مصرف دیوسژنین در موش‌های جهش‌یافته با بیان مضاعف پروتئین پیش‌ساز آمیلوئید باعث بهبودی حافظه آنان می‌شود و قادر است استرس اکسیداتیو و مارکرهای پروآپوپتوتیک التهابی را مهار کند [15]. برخی محققان معتقدند اثر ساپوژنین‌ها بر کاهش آپوپتوز از طریق خواص آنتی‌اکسیدانی‌شان مانع از فعال شدن مسیر JNK و آزاد شدن سیتوکرمC  می‌شود. JNK در فعال کردن آپوپتوز نقش دارد و اثر آنتی‌اکسیدانی خود را با افزایش میزان سوپراکسید دیسموتاز، کاهش BAX، کاهش کاسپاز 3، مهار ROS و تنظیم خانواده 2-BCL بروز می‌دهد. اثر مصرف ساپوژنین بر کاهش آپوپتوز را به نقش آن بر تقویت مسیر AKT/PI3K (فسفاتیدیل اینوزیتول 3- کیناز) و خانواده BCL-2 نسبت می‌دهند. Akt-PI3K یک مسیر سیگنالینگ داخل سلولی است که بقای سلول را تنظیم می‌کند [8]. بررسی‌ها نشان داده‌اند فورستان و تیگوژنین دارای خاصیت ضدالتهابی و کاهش اثرات التهابی هستند و ساپونین‌های استروئیدی مسیرهای التهابی JNK/AP-1 و NFkB/IkB (فاکتور هسته‌ای کاپا / زنجیره سبک بهبوددهنده سلول‌های B فعال) را مهار می‌کنند و مشخصاً التهاب از عوامل ایجاد و تشدید پاتولوژی آلزایمر و افزایش‌دهنده آمیلوئید بتا و سیتوکین‌های التهابی است [16]. مشخص شده است ساپوژنین‌های موجود در عصاره فنوگریک با افزایش مهار استیل‌کولین استراز باعث بهبود آلزایمر در رت شده و این مهار با حضور این آنتی‌اکسیدان‌ها بیشتر می‌شود و ROS درون سلولی را کاهش می‌دهد. همچنین فلاونوئیدها دارای خاصیت مهارکننده استیل‌کولین استراز هستند [17]. مطالعات نشان داده‌اند دونپزیل باعث کاهش پلاک در هیپوکامپ و بهبود حافظه از طریق مسیر BDNF/TrkB می‌شود [18]. 
اخیراً استفاده از گیاهان دارویی با وجود داشتن تأثیرات متعدد و عوارض جانبی کم، توجه محققان را برای درمان بیماری‌ها به خود جلب کرده است. همچنین آنتی‌اکسیدان‌ها و ضدالتهاب‌های طبیعی در دسترس و ارزان‌قیمت می‌توانند به عنوان رژیم غذایی برای افراد با خطر بالای ابتلا به بیماری‌های زمینه‌ای التهابی یا آلزایمر ارثی مورد استفاده قرار گیرند. بنابراین در این تحقیق سعی شد اثر یک ترکیب گیاهی در دسترس بر حافظه فضایی موش مورد بررسی قرار گیرد. رژیم‌ غذایی مناسب ممکن است نه فقط بر ریسک بروز AD، بلکه همچنین بر سندرم‌های پیش از زوال مغزی و پیشرفت زوال مغزی اثرگذار باشد. رژیم غذایی مناسب برای جلوگیری از التهاب عروق مغزی، افزایش کلسترول و افزودن ریسک آلزایمر، لازم است. بنابراین استفاده از رژیم حاوی آنتی‌اکسیدان و ترکیبات گیاهی موجب جلوگیری و بهبود عوامل ابتلا می‌گردد [19]. از این رو هیوسیاموزید که ساپونین استروئیدی گیاه بذرالبنج است احتمالاً با خواص آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهاب، مهارکننده استیل‌کولین استراز و ممانعت از تجمع آمیلوئید ممکن است بر بهبود حافظه در موش‌های مبتلا به آلزایمر مؤثر باشد. از آنجا که تا به حال اثر این ترکیب گیاهی بر حافظه فضایی بررسی نگردیده است، لذا در این تحقیق پژوهشی سعی شد تا ترکیبات گیاهی درمانی مؤثرتر بر بهبود اختلالات یادگیری و حافظه فضایی مورد بررسی قرار گیرد تا افراد با ریسک خطر بالای ابتلا به بیماری‌های التهابی و آلزایمر بتوانند در رژیم غذایی خود از آن مصرف کنند. بنابراین هدف این تحقیق، بررسی اثر دونپزیل و هیوسیاموزید در مقابله با اختلال به‌وجود‌آمده در حافظه فضایی ناشی از تزریق بتا آمیلوئید در رت‌های نر و بررسی میزان تأثیر آن‌ها بر بهبود حافظه فضایی بود. 

در این تحقیق تجربی، شصت سر رت نر نژاد ویستار به وزن تقریبی 180 گرم با سن تقریبی هفت هفته به صورت تصادفی در شش گروه ده‌تایی تقسیم‌بندی شدند. موش‌ها در شرایط استاندارد نور، دمای 2±22 درجه سانتی‌گراد و رطوبت 50 درصد و سیکل نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگه‌داری می‌شدند. حیوانات در گروه‌های زیر مورد مطالعه قرار گرفتند: گروه کنترل که آب و غذای معمولی دریافت کردند و جراحی نشدند؛ گروه PBS‌ که تحت عمل جراحی قرار گرفتند و PBS (حلال Aβ) به جای Aβ تزریق شد؛ گروه آلزایمری اول شامل حیواناتی که تحت عمل جراحی آلزایمری، بتا آمیلوئید دریافت کردند؛ گروه آلزایمری دوم شامل حیواناتی که تحت عمل جراحی آلزایمری قرار گرفتند (بتا آمیلوئید دریافت کرده و پس از 20 روز مبتلا به آلزایمر شدند) و روزانه یک سی‌سی نرمال‌سالین دریافت کردند؛ گروه آلزایمر تیمارشده با دونپزیل که 28 روز، روزانه 4 میلی‌گرم بر کیلوگرم داروی دونپزیل به صورت گاواژ دریافت می‌کردند؛ گروه آلزایمر تیمارشده با هیوسیاموزید که 28 روز، هیوسیاموزید را به میزان روزانه 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم به صورت گاواژ دریافت کردند. با توجه به عدم معنی‌دار بودن نتایج موریس واتر میز گروه کنترل و گروهPBS ، گروه کنترل به عنوان کنترل و به علت یکسان بودن نتایج این آزمون در گروه اول و دوم آلزایمری گروه دوم به عنوان گروه آلزایمری در نظر گرفته شد. 
داروی بتا آمیلوئید‌ از شرکت Sigma Aldrich به میزان 100 میکروگرم در 100 میکرولیتر PBS حل شد. سپس به مدت یک هفته در انکوباتور در دمای 37 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری گردید. 
حیوانات با تزریق کتامین (60 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و زایلازین (10 میلی‌گرم بر کیلوگرم) بی‌هوش می‌شدند. با تراشیدن موهای روی سر از فاصله بین دو چشم تا دو گوش، سپس سوراخ کردن جمجمه در دستگاه استریوتاکس، مقدار 2 میکرولیتر از بتا آمیلوئید 42-1 به وسیله سرنگ همیلتون درون مغز حیوانات با مختصات قدامی - خلفی 0/5، عمق 4 و میانی طرفی 6±/1 میلی‌متر از نقطه برگما با اطلس (0/5=AP از برگما، 6±/1=ML و 4= Dمیلی‌متر) تزریق شد. برای جلوگیری از آسیب مغزی تزریق به‌آهستگی و در مدت 20 دقیقه انجام می‌شد [20]. به منظور رسوب بهتر بتا آمیلوئید 5 دقیقه سرنگ در محل تزریق می‌ماند، 2 دقیقه استراحت و سپس تزریق ادامه می‌یافت. موش‌ها جهت آلزایمری شدن، بتا آمیلوئید را به میزان 2 میکرولیتر به صورت دوطرفه در هیپوکامپ دریافت کردند. کاهش حافظه فضایی در گروه آلزایمر با آزمون موریس واتر میز مشاهده گردید. دونپزیل شرکت داروسازی لقمان به میزان 4 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز و هیوسیاموزید به میزان 10 میلی‌گرم بر کیلوگرم در روز پس از استخراج از گیاه، توسط شیکر در‌ یک سی‌سی نرمال‌سالین کاملاً محلول شده و به صورت گاواژ به موش‌های گروه‌های درمانی خورانده می‌شد.

40 گرم پودر بذرالبنج با 300 سی‌سی محلول شامل 250 سی‌سی متانول و 50 سی‌سی آب مقطر درون دستگاه سوکسیله قرار داده شده، سپس محلول زرد - سبز حاصل شد و بعد از سرد شدن، با کاغذ صافی صاف گردید و با استات سرب 1/5 درصد برای جداسازی تانن، ترپن و سایر ناخالصی‌ها مخلوط شد. محلول حاصله در دمای آزمایشگاه به مدت 5 دقیقه نگه‌داری شده و سپس صاف شد و حاصل صافی به دستگاه دکانتور منتقل شد و با 150 سی‌سی محلول که شامل 60 سی‌سی ایزوپروپانول و 90 سی‌سی کلروفرم بود، دکانته شد. محلول کلروفرمی حاوی هیوسیاموزید کف‌کننده بود و برای خشک کردن به دستگاه روتاری منتقل شد [21].
مطالعه رفتاری (آزمون یادگیری و حافظه فضایی)
در این بررسی، سنجش یادگیری و حافظه فضایی توسط ماز آبی انجام شد و اختلال حافظه که ناشی از آلزایمر است در گروه بیمار مشاهده گردید. ماز یک تانک آبی با قطر 180 و عمق 60 سانتی‌متر بود که نیم آن از آب پر می‌شد. این تانک به چهار ربع تقسیم شده و سکوی نجاتی با ارتفاع 25 سانتی‌متر در یکی از چهار قسمت، 1 تا 2 سانتی‌متر زیر آب قرار داشت. ماز در یک اتاق که علائم فضایی متفاوت آن در طول آزمایش‌ها ثابت بود و نیز برای حیوان درون ماز قابل دید بود، قرار می‌گرفت و از طریق دوربین ردیاب که در ارتفاع 180 سانتی‌متری بالاتر از وسط ماز آبی بود، بررسی و اطلاعات مربوط به آزمایش ذخیره می‌شد. 

حیوان در طی آزمایش از یکی از ربع‌های ماز به طوری که صورت آن به طرف دیواره ماز بود رها می‌گردید. انتخاب محل شروع توسط نرم‌افزار تصادفی پیشنهاد می‌شد. حداکثر زمان آزمایشی که حیوان جهت پیدا کردن سکو در اختیار داشت90 ثانیه بود. در هنگام عدم موفقیت، حیوان به سمت سکو، راهنمایی و 30 ثانیه روی آن قرار می‌گرفت. حیوان با توجه به علائم، موقعیت خود را به خاطر می‌سپرد. اگر حیوان سکو را می‌یافت با قرارگیری روی سکو عمل ضبط متوقف می‌شد و باز هم 30 ثانیه به حیوان برای به خاطر سپردن علامت‌ها وقت داده می‌شد. سپس حیوان به درون ظرف اختصاصی منتقل، خشک و به قفس انتقال داده می‌شد. پس از 10 دقیقه دوباره در ربع دیگری آزمایش تکرار می‌شود. این آزمایش به مدت چهار روز و هر روز چهار بار تکرار می‌شد.

بعد از مرحله اول، یک مرحله آزمون پروب انجام شد که با برداشتن سکو (پروب) حیوان به صورت تصادفی از یکی از جهات ماز رها می‌شد، با این فرض که حیوان محل سکو را به خاطر دارد و باید حداکثر زمان و مسافت را در ربع محل قرارگیری سکو بماند. این مرحله برای هر حیوان یک‌بار در مدت 90 ثانیه تکرار شد.‌‌
در این تحقیق از نرم‌افزار SPSS نسخه 22 برای تجزیه و تحلیل داده‌ها استفاده شد. به منظور بررسی وجود تفاوت معنی‌دار بین گروه‌ها از آزمون آنالیز آماری وان‌وی آنووا و آزمون پست‌هاک متناسب با داده‌ها‌ استفاده شد. ضمناً داده‌ها به صورت میانگین و خطای استاندارد گزارش شدند و سطح معنی‌داری کمتر از 0/05 در نظر گرفته شد.

بر اساس نتایج آزمون ماز آبی موریس، یادگیری و حافظه فضایی موش‌هایی که Aβ را به صورت درون‌هیپوکامپی دریافت کردند، دچار اختلال شد (001/p<0). زمان سپری‌شده و مسافت طی‌شده تا رسیدن به سکوی پنهان در روزهای اول تا سوم آموزش، ملاک یادگیری حیوان و روز چهارم پس از یادگیری ملاک بررسی قرار ‌گرفت. در روز چهارم، موش‌های گروه دوم آلزایمری در مقایسه با گروه اول (کنترل)، به طور معنی‌داری زمان و مسافت بیشتری را صرف یافتن سکوی پنهان کردند (001/p<0). اثر تیمار با دونپزیل و تیمار با هیوسیاموزید بر نقص حافظه القاء‌شده توسط Aβ در موش‌های آلزایمری بررسی شد که تفاوت معنی‌داری با یکدیگر نداشتند (05/p>0). مصرف هیوسیاموزید و دونپزیل توانست تا حد زیادی موجب بهبود نقص یادگیری و حافظه فضایی موش‌های دریافت‌کننده Aβ شود (001/p<0). زمان سپری‌شده و مسافت طی‌شده تا رسیدن به سکو در حیوانات در روز چهارم پس از آموزش از لحاظ معنی‌داری مورد بررسی قرار گرفت که گروه‌های تیمار با دونپزیل و هیوسیاموزید کاهش معنی‌داری در مقایسه با گروه آلزایمر نشان دادند (001/p<0). گروه هیوسیاموزید در روز چهارم تفاوت معنی‌داری را در زمان سپری‌شده در مقایسه با کنترل نشان داد (05/p<0). همچنین بین گروه دونپزیل و گروه کنترل از نظر مدت‌زمان سپری‌شده تفاوت معنی‌داری وجود داشت (01/p<0). گروه درمان با دونپزیل با گروه هیوسیاموزید تفاوت معنی‌داری نداشت (05/p>0). در مورد مسافت پیموده‌شده گروه دونپزیل با کنترل تفاوت معنی‌داری را نشان داد (01/p<0)، در حالی که هیوسیاموزید نسبت به کنترل تفاوت معنی‌دار نداشت (05/p<0). تفاوت‌های معنی‌دار در گروه‌ها نسبت به گروه کنترل بیانگر وجود اختلاف گروه‌های بیمار و درمان‌شده پس از بیماری با حیوانات سالم بود. در گروه‌های درمانی تا حد زیادی بهبود نقص یادگیری و حافظه فضایی موش‌های دریافت‌کننده Aβ مشاهده شد (001/p<0). در روزهای آزمون، زمان سپری‌شده و مسافت طی‌شده تا رسیدن به سکوی پنهان در حیوانات گروه‌های درمان نسبت به گروه آلزایمر کاهش یافت (تصویر شماره 1).



در آزمون پروب (‌که بدون سکوی پنهان اجرا شد)، زمان سپری‌شده در ربع دایره هدف، اساس حافظه فضایی محسوب گردید. کاهش معنی‌داری در زمان سپری‌شده توسط حیوانات گروه آلزایمری در ربع دایره هدف در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد (001/p<0). همچنین مدت‌زمان سپری‌شده در ربع دایره هدف توسط گروه‌های درمان در مقایسه با گروه آلزایمر افزایش معنی‌داری داشت (001/p<0) که بیانگر اثر مثبت تیمارها بر یادگیری و حافظه فضایی موش‌های دریافت‌کننده بتا آمیلوئید بود. گروه‌های تیمار با یکدیگر و نیز با گروه کنترل اختلاف معنی‌دار نداشتند (05/p>0) (تصویر شماره 2).



بحث 
در این مطالعه تجربی، اثر دونپزیل و هیوسیاموزید بر بهبود یادگیری فضایی رت‌های مبتلا به آلزایمر مورد بررسی قرار گرفت. آلزایمری شدن موش‌ها باعث کاهش حافظه فضایی موش‌های نر بالغ نسبت به گروه کنترل گردید و بهبود حافظه فضایی پس از تیمار با دونپزیل و هیوسیاموزید مشاهده شد. در روزهای آزمون، زمان سپری‌شده و مسافت طی‌شده تا رسیدن به سکو در حیوانات گروه‌های درمان نسبت به گروه آلزایمر کاهش معنی‌دار داشت (تصویر شماره 1). بنابراین تیمارها منجر به بهبود حافظه فضایی شدند؛ البته همچنان تا رسیدن به حد موش سالم اختلاف دارند که ناشی از عوارض شدید بیماری آلزایمر و از دست رفتن حافظه است، اما در مقایسه با گروه آلزایمر موجب بهبود عوارض بیماری شدند. عواملی از قبیل تأثیر رسوب بتا آمیلوئید در مغز، اختلال در مسیرهای انتقال پیام، هایپرفسفریلاسیون تائو، التهاب و استرس اکسیداتیو در ایجاد این بیماری دخیل هستند. با پیشرفت آلزایمر و با از دست رفتن حافظه به‌ویژه حافظه فضایی و عدم توانایی در یافتن جهات، اختلالات رفتاری و شناختی ایجاد می‌شود [22].
تزریق بتا آمیلوئید در هیپوکامپ موش باعث ایجاد آلزایمر، اختلال در حافظه و یادگیری آزمایش‌شده در آزمون ماز آبی موریس می‌شود که می‌تواند از طریق افزایش استرس اکسیداتیو موجب اختلال شناختی و ایجاد پلاک شود و این حیوانات در مقایسه با گروه کنترل مدت‌زمان بیشتری برای پیدا کردن سکوی پنهان داخل ماز آبی سپری می‌کنند [23]. نتایج مطالعه حاضر با مطالعات مذکور همسو است، به طوری که در پژوهش حاضر تزریق داخل هیپوکامپی بتا آمیلوئید در حیوانات باعث کاهش حافظه فضایی در مقایسه با‌ گروه‌های کنترل شد؛ چون تفاوت مسافت طی‌شده و زمان سپری‌شده جهت یافتن سکو در گروه کنترل و گروه بیمار معنی‌دار بود (تصویرهای شماره 1 و شماره 2). 
موافق با مطالعه حاضر، رسولی جازی و همکاران گزارش دادند تزریق بتا آمیلوئید 41-1 در ناحیه CA1 هیپوکامپ موش‌های صحرایی نر باعث تخریب نورونی و کاهش حافظه می‌‌شود [24]. مطالعات نشان داده‌اند دونپزیل باعث کاهش پلاک بتا آمیلوئید در هیپوکامپ و بهبود حافظه در مدل tree shrew می‌شود [18]. مواد گیاهی از جمله فلاونوئیدها و ساپونین‌ها دارای اثر مثبت بر یادگیری و حافظه و پلاستیسیته سیناپسی هستند [15]. مصرف ساپونین استروئیدی دیوسژنین (دارای خاصیت استیل‌کولین استرازی) در موش‌های جهش‌یافته با بیان مضاعف APP و PS1 باعث بهبودی حافظه آنان شد و نتیجه ایمونوهیستوشیمی نشان داد درمان با دیوسژنین باعث حذف پلاک Aβ، کاهش مرگ نورون‌ها و انسدادهای نوروفیبریلیال در قشر مغزی و هیپوکامپ و مهار استیل‌کولین استراز شد [15] که این بهبود حافظه در پژوهش حاضر نیز مشهود بود.
مطابق با یافته‌های این تحقیق، استفاده از ساپوژنین استروئیدی منجر به بهبود حافظه در آزمون رفتاری ماز آبی موریس در موش 5XFAD شد و بررسی‌های بافتی، از بین رفتن پلاک‌های بتا آمیلوئید را نشان داد [25]. 
در موش با تجمع بتا آمیلوئید، فعالیت AChE (استیل‌کولین استراز) افزایش می‌یابد، اما با مصرف ساپوژنین‌ها کاهش AChE و افزایش بیان BCL-2 مشاهده شد که تحریک‌کننده NGF (فاکتور رشد نورونی) نیز هستند. محققین در تلاش‌اند تا با دست‌یابی به داروهای جدید که علاوه بر اثرات بیشتر، حداقل عوارض جانبی را نیز داشته باشند از منابع گیاهی جهت یافتن داروهای جدید استفاده کنند [17]. نتایج حاصل از این مطالعه نیز بیان می‌کنند که مصرف دونپزیل و هیوسیاموزید باعث افزایش معنی‌دار حافظه فضایی موش‌ها شده که همسو با مطالعات گذشته است.
علائم اولیه بیماری آلزایمر، مختل شدن تدریجی حافظه به‌خصوص حافظه فضایی است و با بررسی اثر تزریق بتا آمیلوئید در مغز موش‌های صحرایی و اثر آن بر یادگیری دریافتند که این حیوانات در مقایسه با حیوانات کنترل در مدت‌زمان بیشتر سکوی مخفی درون ماز آبی را پیدا می‌کنند [26]. تأثیر مهارکننده‌های استیل‌کولین استراز بر بهبود بیماری آلزایمر از طریق افزایش انتقال سیناپس‌های کولینرژیک و کاهش رادیکال‌های آزاد است. رسوب بتا آمیلوئید در دیواره عروق مغزی موجب کاهش اتساع عروق می‌شود و از دلایل دیگر آن می‌توان به آتروفی مغز اشاره کرد که در پی تحریک مغز باعث کاهش نیاز به جریان خون شده، در‌نتیجه منجر به کاهش جریان خون عروق مغز می‌شود. استفاده از فلاونوئیدها بهبوددهنده این جریان مغزی است [16]. 
چوئی و همکاران در سال 2001 در بررسی اثر تزریق بتا آمیلوئید در مغز موش‌های صحرایی و اثر آن بر یادگیری و سیستم کولینرژیک دریافتند که این حیوانات در مقایسه با حیوانات کنترل در مدت‌زمان بیشتری سکوی مخفی درون ماز آبی را پیدا می‌کنند. نتایج این مطالعه نشان داد تزریق بتا آمیلوئید در مغز سبب آسیب رساندن به حافظه می‌شود و درمان با بهبوددهندگان میزان استیل‌کولین باعث بهبود حافظه می‌شود [22]. مطالعات نشان داده‌اند ساپونین‌ها بهبود‌دهنده حافظه در موش‌های آلزایمری هستند و در درمان بیماری‌های عصبی با جلوگیری از تشکیل پلاک و مرگ نورونی تأثیر دارند [27]. نتایج ذکرشده و مباحث مذکور، صحت یافته‌های این پژوهش را تأیید می‌کنند. ساپوژنین شیرین‌بیان از طریق فعال کردن مسیر Nrf2 که تنظیم‌کننده‌ای در برابر مواد اکسیداتیو است موجب کاهش سیتوکین‌های التهابی IL-6 ،IL-1 و TNF-α و افزایش سیتوکین‌های ضدالتهابی IL-4 و IL-10 می‌شود و در‌نهایت التهاب در سیروز کبدی و سطح سرمی آنزیم‌های کبدی را کاهش می‌دهد [28] که می‌تواند از جمله مسیرهای بهبود التهاب مغزی و در‌نتیجه حافظه نیز باشد. ساپوژنین‌های استروئیدی خارخاسک باعث بهبود فعالیت سوپراکسید دیسموتاز و پراکسیداسیون چربی‌ها شده و بین کلسترول خوب و بد تعادل برقرار می‌کنند و نقش محافظتی در دیابت القاءشده با استرپتوزوسین در رت نشان می‌دهند. دیابت با ایجاد اختلال در یادگیری، حافظه، شناخت، آتروفی مغز و بالا رفتن احتمال ابتلا به دمانس همراه است. ساپونین‌های استروئیدی از جمله دیوسژنین و تیگوژنین دارای خواص ضدالتهابی، آنتی‌اکسیدان، ضددیابت و مهارکنندگی استیل‌کولین استراز هستند [29]. نتایج مطالعه حاضر با مطالعات مذکور همسو است، به طوری که در پژوهش حاضر تزریق داخل هیپوکامپی بتا آمیلوئید 42-1 در موش‌ها باعث کاهش حافظه فضایی در مقایسه با گروه‌های کنترل شد و تیمارها با دونپزیل و هیوسیاموزید باعث افزایش معنی‌دار حافظه به‌ویژه در بهبود زمان و مسافت طی‌شده برای یافتن سکو شد که همسو با مطالعات گذشته است.
یکی از عوامل مؤثر در پیری، تجمع Aβ، کاهش توان بدن برای محافظت از خود در برابر التهابات و آسیب‌های اکسیداتیو است. رادیکال‌های آزاد که در اثر مصرف مقادیر بالای اکسیژن توسط مغز ایجاد شده‌اند باعث آسیب‌های جبران‌ناپذیر به نورون‌ها می‌شوند. از جمله راهکار‌های مهم در حفظ سلامت سیستم مغز، شناسایی مواد غذایی با خاصیت محافظ نورونی است. مواد موجود در میوه و سبزیجات اثرات ضدالتهابی و آنتی‌اکسیدانی دارند که با مقابله با استرس اکسیداتیو، باعث حفظ سلامت و بهبود عملکرد نورون‌های مغزی می‌شوند. ساپوژنین‌ها با خواص آنتی‌اکسیدانی از طریق مسیر NF-kB باعث مهار IL-6 ،‌TNFα و التهاب می‌شوند و نیز تولید رادیکال‌های آزاد ناشی از آن‌ها را مهار می‌کنند و افزایش‌دهنده کاتالاز هستند [27]. هیپوکامپ و ساختارهای اطرافش و نورون‌های کولینرژیک آن از ابتدایی‌ترین ساختارهایی هستند که تحت تأثیر تغییرات پاتولوژی AD قرار می‌گیرند. اختلالات کولینرژیک در بیماری آلزایمر بسیار برجسته‌اند. درمان با دونپزیل منجر به بهبود التهاب عصبی، آسیب تائو، از دست دادن سیناپسی و نورونی و همچنین کاهش ماندگاری تائو و فسفوریلاسیون از مسیر JNK در مغز موش PS19 می‌شود و نشان داده شده است استیل‌کولین برای سرکوب التهاب نقش مهمی در نورون‌ها ایفا می‌کند [30]. 
برخلاف نتایج مطالعه حاضر با ایجاد تخریب در حافظه با تزریق اسکوپولامین به موش صحرایی و تیمار با دوز پایین دونپزیل، اثر اسکوپولامین آنتاگونیزه نشد [31]. فلاونوئیدها و ترکیبات گیاهی سبب بهبود خون‌رسانی به مغز شده و در افزایش حافظه و توانایی یادگیری نقش دارند. از مکانیسم‌های احتمالی اثرات فلاونوئیدها در عملکرد مغزی، ارتباط آن‌ها با فرایندهای مؤثر در بقای سلول، تمایز، بهبود فعالیت کولینرژیک، مهار استیل‌کولین استراز و شکل‌گیری حافظه است. در موش‌های صحرایی نشان داده شده است ترکیب‌های فلاونوئیدی قادر به اثرگذاری مثبت بر حافظه کوتاه‌مدت هستند [25]. 
با توجه به نتایج مطالعه حاضر، کاهش زمان سپری‌شده و مسافت طی‌شده در گروه‌های تحت تیمار با هیوسیاموزید و دونپزیل در مقایسه با گروه آلزایمری مشاهده شد. با توجه به کاهش معنی‌دار زمان و مسافت سپری‌شده جهت یافتن سکوی مخفی می‌توان نتیجه گرفت که دونپزیل و هیوسیاموزید می‌توانند در بهبود بیماری آلزایمر مؤثر باشند. شواهد روزافزون نشان می‌دهند آنتی‌کولین استرازها دارای اثرات حفاظت‌کننده نورونی و عملکرد کولینرژیک هستند [27]. درمان با دونپزیل به طور قابل توجهی باعث کاهش سطح بیان در mRNAی استیل‌کولین استراز، BACE1 (آﻧــﺰﻳﻢ ﺑــﺮش‌دهنده ﺟﺎﻳﮕــﺎه ﺑﺘــﺎ در ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦ ﭘﻴﺶ‌ﺳﺎز آﻣﻴﻠﻮﺋﻴﺪی) و افزایش میزان بیان استیل‌ترانسفراز می‌شود که کاهش میزان استیل‌کولین در‌نتیجه آزاد شدن زیاد آنزیم استیل‌کولین استراز نیز از دیگر دلایل بروز آلزایمر است و حافظه فضایی را مختل می‌کند [32]. نتایج حاصل از این مطالعه نیز بیان می‌کند که مصرف دونپزیل و هیوسیاموزید به مدت 28 روز، باعث افزایش معنی‌دار حافظه فضایی موش‌ها شده که همسو با مطالعات گذشته است. 
یکی از راهبردهای درمانی انتخابی، افزایش سطح استیل‌کولین در مغز افراد مبتلا به این بیماری با استفاده از مهارکننده‌های کولین‌استراز مانند داروی دونپزیل است که این داروها تجزیه استیل‌کولین سیناپسی را کاهش داده، توانایی آن را برای تحریک گیرنده‌های پس‌سیناپسی طولانی‌تر می‌کنند. این دارو در تثبیت حافظه و قدرت تفکر اهمیت زیادی داشته و الگوی طبیعی آزاد شدن استیل‌کولین در مغز را تقویت می‌نماید. همچنین بر ساب‌یونیت‌های NMDA رسپتور، NOS1 و گلیکوژن‌سنتتاز (برای فسفریلاسیون تائو مهم است)، مهار آنزیم کلیدی تشکیل آمیلوئید و بتا- سکرتاز (BACE-1) نیز مؤثر است [10]. در مطالعات مشخص شد آلزایمری کردن موش‌ها با Aβ1-42 منجر به ایجاد پاسخ التهابی شده و مداوا با مصرف دونپزیل باعث بهبود آزمون موریس واتر میز و کاهش سیتوکین‌های التهابی در موش‌های آلزایمری می‌شود [16]. ساپونین‌های استروئیدی فنوگریک (fenugreek) با افزایش مهار AChE، آلزایمر را بهبود می‌بخشند و پیشنهاد شده است که این ترکیبات با خاصیت آنتی‌اکسیدانی باعث کاهش ROS درون‌سلولی می‌شوند. همچنین ترکیبات گیاهی به علت خواص آنتی‌اکسیدانی می‌توانند سمیت Aβ و استرس اکسیداتیو و التهاب ناشی از آن را کاهش دهند و مانع مرگ سلولی شوند [17]. نتایج بررسی حاضر نشان داد استفاده از دونپزیل و هیوسیاموزید باعث بهبود حافظه می‌شود. بنابراین احتمالاً تیمار با دونپزیل و هیوسیاموزید باعث بهبود وضعیت ایجاد پلاک و از دست دادن حافظه به واسطه پلاک و نقص سیستم کولینرژیک می‌شود که می‌تواند ناشی از فعالیت مهارکنندگی استیل‌کولین استرازی و آنتی‌اکسیدانی باشد. تحقیقات نشان می‌دهند AChEI‌، سلول را به طور مستقیم در برابر آسیب ناشی از بتا آمیلوئید محافظت می‌کند و اخیراً نشان داده شده است دونپزیل از سلول‌های عصبی مصنوعی موش در مقابل سمیت بتا آمیلوئید محافظت می‌کند [11]. در حال حاضر شواهد به نقش ضدالتهابی AChEI‌ها از طریق اقدام علیه رادیکال‌های آزاد و سمیت آمیلوئید و نیز از طریق کاهش انتشار سیترات‌ها از میکروگلیای فعال در مغز و خون اشاره می‌کنند. این بدون شک امید بیشتری را در درمان پاتوژنز AD و تعامل بین عوامل مختلف پاتولوژیک درگیر در علل بیماری نشان می‌دهد [9]. نتایج مطالعات اخیر نشان داده‌اند دونپزیل و هیوسیاموزید به طور اثربخشی سبب کاهش آسیب‌های شناختی ناشی از افزایش سطوح Aβ یا کاهش فعالیت کولینرژیک می‌شوند. همچنین دونپزیل و هیوسیاموزید فعالیت‌های آنتی‌کولین استراز، ضد‌التهابی و آنتی‌اکسیدانی قابل ملاحظه‌ای را طبق مطالعات انجام‌شده در سالیان گذشته اعمال می‌کنند.
اثر دونپزیل از طریق چندین مکانیسم شامل فعالیت‌های آنتی‌کولین‌استراز و اثرات ضد‌التهابی به اثبات رسیده است. دونپزیل دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی است و از تخریب نورونی و اختلال حافظه فضایی ممانعت به عمل می‌آورد و سبب بهبود اختلال حافظه فضایی می‌شود [33]. نتایج حاصل از مطالعه ما نیز از نظر تأثیر دونپزیل بر بهبود یادگیری و حافظه با موارد گفته‌شده همخوانی دارد. کوئرستین و ساپوژنین‌ها نیز به عنوان آنتی‌اکسیدان بسیار قوی رادیکال‌های هیدروکسیل و سوپراکسید تولیدشده در بافت را خنثی می‌کنند و در مهار کردن استرس اکسیداتیو و التهاب فعالیت دارند [34]. بر اساس مطالعات مشابه، تیمار‌ها با خواص آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی مانع تشکیل پلاک و مرگ نورونی و پیشرفت آلزایمر می‌شوند. بنابراین به نظر می‌رسد که در درمان با هیوسیاموزید، با کاهش استرس اکسیداتیو و نیز بهبود اعمال شناختی، افزایش محافظت عصبی، کاهش التهاب و تنظیم اعمال کولینرژیک موجب بهبود حافظه و یادگیری در موش‌های صحرایی مدل آلزایمر و تحت تیمار با هیوسیاموزید می‌شوند.

با توجه به نتایج حاصل از مطالعات گذشته و مطالعه اخیر پیشنهاد می‌شود مصرف هیوسیاموزید و دونپزیل در رژیم غذایی روزانه افراد با خطر ابتلای بالا به آلزایمر به منظور پیشگیری از این بیماری وارد شود. همچنین مصرف هیوسیاموزید در افراد مبتلا باعث بهبود بیماری می‌‌شود که احتمالاً این بهبود با تأثیر بر عوامل ایجاد آلزایمر از قبیل تجمع پلاک بتا آمیلوئید، اختلالات سیستم کولینرژیک، استرس اکسیداتیو، التهاب و جلوگیری از آپوپتوز نورونی صورت می‌گیرد.

این تحقیق در دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات با شناسه اخلاق REC.1397.057. IR.IAU.SRB تأیید شده است.

ایــن مقالــه منتــج از پایان‌نامــه دانشــجویی مقطــع دکتــری نویسنده اول در گروه زیست‌شناسی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران اســت.

تمامی نویسندگان معیارهای استاندارد نویسندگی بر اساس پیشنهادات کمیته بین‌المللی ناشران مجلات پزشکی International Committee of Medical Journal Editors  را دارا بودند و همگی به یک اندازه در نگارش اثر مشارکت داشتند.

بدین‌وسیله نویسندگان تصریح می‌کنند که هیچ‌گونه تضاد منافعی در خصوص پژوهش حاضر وجود ندارد.