مقدمه 

مواد و روش‌ها

این مطالعه مورد ـ شاهدی روی 94 فرد مبتلا به لوسمی میلوئیدی حاد به عنوان گروه مورد و 99 فرد سالم به عنوان گروه کنترل انجام گرفت. تمامی افراد بزرگسال مراجعه‌کننده به بیمارستان‌های دو استان فارس و اصفهان از مهر 1397 تا شهریور 1398 که دارای شاخص‌های لوسمی میلوئیدی حاد بودند و بیماری آن‌ها توسط پزشک متخصص تشخیص داده شده بود، وارد گروه بیمار (مورد) شدند. همچنین افراد فاقد سرطان که از نظر سن و جنس با نمونه‌های سرطانی همسان شده بودند وارد گروه کنترل شدند. افراد با سابقه هرگونه بیماری‌های داخلی از مطالعه خارج شدند. خصوصیات جمعیت‌شناختی افراد مورد بررسی در جدول شماره 1 ارائه شده است. 



پس از اخذ رضایت‌نامه از افراد مورد مطالعه و پر کردن پرسش‌نامه، 5 میلی‌لیتر خون محیطی در لوله‌های حاوی EDTA جمع‌آوری شد. پس از جمع‌آوری کلیه نمونه‌ها، DNA به روش Salting out توسط کیت شرکت GeNet Bio ساخت کره جنوبی استخراج شد. سپس DNA استخراج‌شده در تیوب‌های 1/5 میلی‌لیتری جمع‌آوری شد و به فریزر در دمای منهای 20 درجه سانتی‌گراد منتقل شد. در ادامه، کیفیت DNA استخراج‌شده روی ژل آگارز 1 درصد مشخص شد و تعیین پلی‌مورفیسم (A/C)rs104893674 با استفاده از روش Tetra Primer ARMS PCR در حضور آغازگر که براساس توالی ژن مربوطه توسط نرم‌افزارهای ملکولی Oligo 7 و Blast طراحی و سپس توسط شرکت Macrogen سنتز شده بود، انجام گرفت (جدول شماره 2). 



مخلوط واکنش PCR در حجم نهایی 22 میکرولیتر شامل 5 میکرولیتر H₂O (آب مقطر استریل)، یک میکرولیتر (10 پیکومول) از هر پرایمر کنترل رفت، کنترل برگشت، پرایمر برگشت و پرایمر آلل‌های C و A، 11 میکرولیتر مسترمیکس 2x PCR Master Mix Red. Mg cl2 (Ampliqon, Odense, Denmark) و یک میکرولیتر DNA ژنومیک آماده شد و تحت برنامه دمای - زمانی مربوطه قرار گرفت (جدول شماره 3).



محصول PCR، برای آلل C و A روی ژل آگارز 2 درصد در ولتاژ 100 ولت به مدت 35 دقیقه الکتروفورز شد و باندهای ظاهرشده با استفاده از Klac CD Gel Documentation System مشاهده شدند (تصویر شماره 1).



تجزیه و تحلیل داده‌ها با کمک نرم‌افزار SPSS نسخه 23 و آزمون‌ آماری مجذور کای صورت گرفت. 

یافته‌ها

نتایج ARMS-PCR

نتایج تست Tetra Primer ARMS PCR نشان‌دهنده قطعات تکثیریافته‌ای به طول 169 جفت باز برای ژنوتیپ CC و 237 جفت باز برای ژنوتیپ AC حاصل از تکثیر ژن ZAP-70 در موقعیت (A/C) rs104893674 بود. از آنجایی که در بین نمونه‌ها افرادی با ژنوتیپ AA یافت نشد، محصول تکثیریافته‌ای برای آن روی ژل نمایان نشد.
مقایسه فراوانی آلل‌های A و C در موقعیت پلی‌مورفیسمی rs104893674 در بیماران و گروه کنترل
نتایج حاصل از آزمون مجذور کای ارتباط معنی‌داری را بین گروه کنترل و بیمار در فراوانی هر دو آلل A و C در موقعیت‌ پلی‌مورفیسمی rs104893674 نشان داد (P=0/000). نتایج شانس ابتلای 2/19 برابری برای لوسمی میلوئیدی حاد را در نتیجه حضور آلل A در این جایگاه چندشکلی اثبات کرد (2/19= OR) (جدول شماره 4).



مقایسه فراوانی ژنوتیپ‌های CC، AC و AA پلی‌مورفیسم rs104893674 در بیماران و گروه کنترل
نتایج حاصل از آزمون مجذور کای ارتباط معنی‌داری را بین گروه کنترل و بیمار در فراوانی ژنوتیپ‌های CC و AC در موقعیت  پلی‌مورفیسمی rs104893674 نشان داد (P=0/000). در بین نمونه‌ها ژنوتیپ AA مشاهده نشد. شانس 1/57 برابری ابتلا به لوسمی میلوئیدی حاد برای افراد دارای ژنوتیپ AC در این موقیعت ژنتیکی تعیین شد (1/57=OR) (جدول شماره 5).



 

بحث

نتیجه‌گیری

ملاحظات اخلاقی

پیروی از اصول اخلاق پژوهش

حامی مالی

مشارکت نویسندگان

تعارض منافع

تشکر و قدردانی

References

1.Babaei M, Mousavi S, Malek M, Tosi G, Zolfaghari M, Danaei N, et al. Cancer occurrence in Semnan Province, Iran: Results of a population-based cancer registry. Asian Pac J Cancer Prev. 2005; 6(2):159-64. http://eprints.semums.ac.ir/860/1/APJCP_Volume_6_Issue_2_Pages_159-164.pdf

2.Zand AM, Imani S, Sa’adati M, Borna H, Ziaei R, Honari H. [Effect of age, gender and blood group on blood cancer types (Persian)]. Kowsar Med J. 2010; 15(2):111-4. https://www.sid.ir/en/Journal/ViewPaper.aspx?ID=175155

3.Robin KO, Mervin CY. Hematology, immunology and infectious disease: neonatology questions and controversies. 1th ed. Philadelphia: Saunders; 2008. https://www.elsevier.com/books/hematology-immunology-and-infectious-disease-neonatology-questions-and-controversies/ohls/978-1-4160-3158-1

4.Kupsa T, Horacek JM, Jebavy L. The role of cytokines in acute myeloid leukemia: A systematic review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2012; 156(4):291-301. [DOI:10.5507/bp.2012.108] [PMID]

5.Fauci AS, Hauser SL, Kasper DL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J. Oncology and hematology. Harrison’s principles of internal medicine. 19th ed. New York: McGraw Hill Education; 2015. https://www.worldcat.org/title/harrisons-principles-of-internal-medicine/oclc/907408102#details-allauthors

6.Steffen B, Muller-Tidow C, Schwable J, Berdel WE, Serve H. The molecular pathogenesis of acute myeloid leukemia. Crit Rev Oncol Hematol. 2005; 56(2):195-221. [DOI:10.1016/j.critrevonc.2004.10.012] [PMID]

7.Parkin DM, Whelan SL, Ferlay J, Teppo L, Thomas DB. Cancer incidence in five continents. IARC Sci Publ. 2002; 8(155). https://publications.iarc.fr/Book-And-Report-Series/Iarc-Scientific-Publications/Cancer-Incidence-In-Five-Continents-Volume-VIII-2002

8.Saffar A, Rahgozar M, Shahi F, Biglarian A. [Survival analysis of acute myeloid leukemia (Persian)]. Iran Uni Med Sci. 2015; 22(134):41-8. http://rjms.iums.ac.ir/article-1-3921-en.html

9.Chang FH, Tzeng DS, Lee TM, Chen TC, Hsu LS, Lung FW. Mutations in the p53 tumor suppressor gene in colorectal cancer in Taiwan. Kaohsiung J Med Sci. 2003; 19(4):151-8. [DOI:10.1016/S1607-551X(09)70464-4] [PMID]

10.Wang H, Kadlecek TA, Au-Yeung BB, Goodfellow HES, Hsu LY, Freedman TS. ZAP-70: An essential kinase in T-cell signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010; 2(5):a002279. [DOI:10.1101/cshperspect.a002279] [PMID] [PMCID]

11.Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009; 27:591-619. [DOI:10.1146/annurev.immunol.021908.132706] [PMID] [PMCID]

12.Morrison DK. MAP kinase pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012; 4(11):a011254. [DOI:10.1101/cshperspect.a011254] [PMID] [PMCID]

13.Parikh SA, Shanafelt TD. Risk factors for Richter syndrome in chronic lymphocytic leukemia. Curr Hematol Malig Rep. 2014; 9(3):294-9.‏ [DOI:10.1007/s11899-014-0223-4] [PMID]

14.Alsadeq A, Fedders H, Vokuhl C, Belau NM, Zimmermann M, Wirbelauer T, et al. The role of ZAP70 kinase in acute lymphoblastic leukemia infiltration into the central nervous system. Haematologica. 2017; 102(2):346-55. [DOI:10.3324/haematol.2016.147744] [PMID] [PMCID]

15.Torkaman A, Moghaddam Charkari N, Aghaeipour M. An approach for leukemia classification based on cooperative game theory. Anal Cell Pathol (Amst). 2011; 34(5):235-46. [DOI:10.1155/2011/212174] [PMCID] 

16.Ferjeni Z, Bouzid D, Fourati H, Stayoussef M, Abida O, Kammoun T, et al. Association of TCR/CD3, PTPN22, CD28 and ZAP70 gene polymorphisms with type 1 diabetes risk in Tunisian population: Family based association study. Immunol Lett. 2015; 163(1):1-7. [DOI:10.1016/j.imlet.2014.11.005] [PMID]

17.Chen S-Y, Liu M-F, Wang C-R. Genetic polymorphism of 3′ untranslated region of zeta-chain associated protein kinase 70 kDa in southern Taiwanese patients with rheumatoid arthritis. Clinical rheumatology. 2016; 35(3):747-50. [DOI:10.1007/s10067-015-3044-5] [PMID]

18.Chinn IK, Sanders RP, Stray-Pedersen A, Coban-Akdemir ZH, Kim VH-D, Dadi H, et al. Novel combined immune deficiency and radiation sensitivity blended phenotype in an adult with biallelic variations in ZAP70 and RNF168. Front Immunol. 2017; 8:576. [DOI:10.3389/fimmu.2017.00576] [PMID] [PMCID]