دوره 24، شماره 3 - ( مرداد و شهریور 1400 )
جلد 24 شماره 3 صفحات 385-372 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Bahrami M, Ghazavi A, Ganji A, Mosayebi G. Observing the Anti-oxidant and Anti-inflammatory Effect of Nigella Sativa Combined With Silybum Marianum Extracts on the Acute Peritonitis Mouse Model. J Arak Uni Med Sci 2021; 24 (3) :372-385
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6305-fa.html
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6305-fa.html
بهرامی مریم، قضاوی علی، گنجی علی، مسیبی قاسم. مقایسه اثر توام آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی عصاره‌های الکلی خارمریم و سیاه‌دانه در مدل موشی پریتونیت حاد. مجله دانشگاه علوم پزشكي اراك. 1400; 24 (3) :372-385
مریم بهرامی1 
، علی قضاوی1 ، علی گنجی1 ، قاسم مسیبی 2
، علی قضاوی1 ، علی گنجی1 ، قاسم مسیبی 2
1- گروه ایمنی‌شناسی و میکروب‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم‌پزشکی اراک، اراک، ایران.
2- گروه ایمنی‌شناسی و میکروب‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم‌پزشکی اراک، اراک، ایران. ،ghasemmosayebi@arakmu.ac.ir
2- گروه ایمنی‌شناسی و میکروب‌شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم‌پزشکی اراک، اراک، ایران. ،
متن کامل [PDF 4386 kb]
(677 دریافت)
| چکیده (HTML) (1798 مشاهده)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
References
1.Ganji A, Farahani I, Palizvan MR, Ghazavi A, Ejtehadifar M, Ebrahimimonfared M, et al. Therapeutic effects of walnut oil on the animal model of multiple sclerosis. Nutr Neurosci. 2019; 22(3):215-22.[DOI:10.1080/1028415X.2017.1371389]
2.Ghazavi A, Mosayebi G, Solhi H, Rafiei M, Moazzeni SM. Serum markers of inflammation and oxidative stress in chronic opium (Taryak) smokers. Immunol Lett. 2013; 153(1-2):22-6. [DOI:10.1016/j.imlet.2013.07.001]
3.Jones RS, Claridge JA. Acute abdomen. In: Townsend CM, Sabiston DC, editors. Sabiston Textbook of Surgery, 17th edition. Philadelphia: Elsevior SAounders; 2004. https://books.google.com/books?id=8b_IRwAACAAJ&dq
4.Mion CM, Béraud JJ. Treatment of acute renal failure by peritoneal dialysis. In Acute Renal Failure. Boston: Springer; 1984. https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4613-2841-4_24
5.Amirghofran Z. Medicinal plants as immunosuppressive agents in traditional Iranian medicine. Iran J Immunol. 2010; 7(2):65-73.[PMID]
6.Woo CC, Kumar AP, Sethi G, Tan KHB. Thymoquinone: Potential cure for inflammatory disorders and cancer. Biochem Pharmacol. 2012; 83(4):443-51. [DOI:10.1016/j.bcp.2011.09.029][PMID]
7.Lirussi F, Beccarello A, Zanette G, De Monte A, Donadon V, Velussi M, et al. Silybin-beta-cyclodextrin in the treatment of patients with diabetes mellitus and alcoholic liver disease. Efficacy study of a new preparation of an anti-oxidant agent. Diabetes Nutr Metab. 2002; 15(4):222-31. [PMID]
8.Agrawal S, Bonkovsky HL. Management of nonalcoholic steatohepatitis: An analytic review. J Clin Gastroenterol. 2002; 35(3):253-61.[DOI:10.1097/00004836-200209000-00011]
9.Lucena MI, Andrade RJ, de la Cruz JP, Rodriguez-Mendizabal M, Blanco E, de la Cuesta FS. Effects of silymarin MZ-80 on oxidative stress in patients with alcoholic cirrhosis. Int J Clin Pharmacol Ther. 2002; 40(1):2-8. [DOI:10.5414/CPP40002]
10.Tavakkoli A, Mahdian V, Razavi BM, Hosseinzadeh H. Review on clinical trials of black seed (Nigella sativa ) and its active constituent, thymoquinone. J Pharmacopuncture. 2017; 20(3):179-93. [DOI:10.3831/KPI.2017.20.021] [PMID] [PMCID]
11.Esmaeil N, Balouchi Anaraki S, Gharagozloo M, Moayedi B. Silymarin impacts on immune system as an immunomodulator: One key for many locks. Int Immunopharmacol. 2017; 50:194-201. [DOI:10.1016/j.intimp.2017.06.030]
12.Wianowska D, Wiśniewski M. Simplified procedure of silymarin extraction from silybum marianum L. Gaertner. J Chromatogr Sci. 2015; 53(2):366-72.[DOI:10.1093/chromsci/bmu049]
13.Koshak AE, Yousif NM, Fiebich BL, Koshak EA, Heinrich M. Comparative immunomodulatory activity of Nigella sativa l. preparations on proinflammatory mediators: A focus on asthma. Front Pharmacol. 2018; 9:1075. [PMID] [PMCID]
14.Noel PRB, Barnett KC, Davies RE, Jolly DW, Leahy JS, Mawdesley-E, et al. The toxicity of dimethyl sulphoxide (DMSO) for the dog, pig, rat and rabbit. Toxicol. 1975; 3(2):143-69. [DOI:10.1016/0300-483X(75)90081-5]
15.Xu T, Qiao J, Zhao L, He G, Li K, Wang J, et al. Effect of dexamethasone on acute respiratory distress syndrome induced by the H5N1 virus in mice. Eur Respir J. 2009; 33:852-60. [DOI:10.1183/09031936.00130507]
16.Vahdati-Mashhadian N, Rakhshandeh H, Omidi A. An investigation on LD50 and subacute hepatic toxicity of Nigella sativa seed extracts in mice. Int J Pharm Sci. 2005; 60(7):544-7. https://www.ingentaconnect.com/content/govi/pharmaz/2005/00000060/00000007/art00013
17.Soufy NI. Hepatoprotective and antioxidant effects of Silybum marianum plant against hepatotoxicity induced by carbon tetrachloride in rats. J Am Sci. 2012; 8(4):479-86. http://www.jofamericanscience.org/journals/am-sci/am0804/064_8482am0804_479_486.pdf
18.Kitano M. Updating of OECD guidelines for the testing of chemicals. Wat Sci Tech. 1992; 25(11):465-72. https://www.proquest.com/docview/1943169657
19.Lam D, Harris D, Qin Z. Inflammatory mediator profiling reveals immune properties of chemotactic gradients and macrophage mediator production inhibition during thioglycollate elicited peritoneal inflammation. Mediators Inflamm. 2013; 1-9. [DOI:10.1155/2013/931562]
20.Benzie IFF, Strain JJ. The Ferric Reducing Ability Of Plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Anal Biochem. 1996; 239(1):70-6.[DOI:10.1006/abio.1996.0292]
21.Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem. 1982; 126(1):131-8. [DOI:10.1016/0003-2697(82)90118-X
22.Gholamnezhad Z, Keyhanmanesh R, Boskabady MH. Anti-inflammatory, antioxidant, and immunomodulatory aspects of Nigella sativa for its preventive and bronchodilatory effects on obstructive respiratory diseases: A review of basic and clinical evidence. J Funct Foods. 2015; 17:910-27. [DOI:10.1016/j.jff.2015.06.032]
23.Gharagozloo M, Jafari S, Esmaeil N, Javid EN, Bagherpour B, Rezaei A. Immunosuppressive effect of silymarin on mitogen-activated protein kinase signalling pathway: The impact on T cell proliferation and cytokine production. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2013; 113(3):209-14. [DOI:10.1111/bcpt.12088]
24.Majdalawieh AF, Hmaidan R, Carr RI. Nigella sativa modulates splenocyte proliferation, Th1/Th2 cytokine profile, macrophage function and NK anti-tumor activity. J Ethnopharmacol. 2010; 131(2):268-75. [DOI:10.1016/j.jep.2010.06.030]
25.Hajhashemi V, Ghannadi A, Jafarabadi H. Black cumin seed essential oil, as a potent analgesic and antiinflammatory drug. Phytother Res. 2004; 18(3):195-9. [DOI: 10.1002/ptr.1390]
26.Bahmani M, Shirzad H, Rafieian S, Rafieian-Kopaei M. Silybum marianum: Beyond hepatoprotection. J Evid Based Complementary Altern Med. 2015; 20(4):292-301. [DOI:10.1177/2156587215571116]
27.Meddeb W, Rezig L, Zarrouk A, Nury T, Vejux A, Prost M, et al. Cytoprotective activities of milk thistle seed oil used in traditional tunisian medicine on 7-ketocholesterol and 24s-hydroxycholesterol-induced toxicity on 158N murine oligodendrocytes. Antioxidants (Basel). 2018; 7(7):95. [DOI:10.3390/antiox7070095]
28.Anvari D, Jamei R. Evaluation of antioxidant capacity and phenolic content in ethanolic extracts of leaves and flowers of some asteraceae species. Recent Pat Food Nutr Agric. 2018; 9(1):42-9. [PMID]
29.Ramadan MF, Kroh LW, Mörsel JT. Radical scavenging activity of black cumin (Nigella sativa L.), coriander (Coriandrum sativum L.), and niger (Guizotia abyssinica Cass.) crude seed oils and oil fractions. J Agric Food Chem. 2003; 51(24):6961-9. [DOI:10.1021/jf0346713][PMID]
30.Shahin YR, Elguindy NM, Abdel Bary A, Balbaa M. The protective mechanism of Nigella sativa against diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma through its antioxidant effect and EGFR/ERK1/2 signaling. Environ Toxicol. 2018; 33(8):885-98. [DOI:10.1002/tox.22574]
31.Umar S, Zargan J, Umar K, Ahmad S, Katiyar CK, Khan HA. Modulation of the oxidative stress and inflammatory cytokine response by thymoquinone in the collagen induced arthritis in Wistar rats. Chem Biol Interact. 2012; 197(1):40-6. [DOI:10.1016/j.cbi.2012.03.003]
32.Kang JS, Jeon YJ, Kim HM, Han SH, Yang KH. Inhibition of inducible nitric-oxide synthase expression by silymarin in lipopolysaccharide-stimulated macrophages. J Pharmacol Exp Ther. 2002; 302(1):138-44. [DOI:10.1124/jpet.302.1.138]
متن کامل: (1693 مشاهده)
مقدمه
التهاب نقش کلیدی در پاتوژنز بسیاری از بیماری‌ها از جمله پریتونیت را ایفا می‌کند. در این میان رادیکال‌های آزاد اکسیژن و نیتروژن جایگاه ویژه‌ای در مدیریت التهاب دارند [1]. رادیکال‌های آزاد به علت وجود الکترون تک، دائماً در بدن در حال گردش هستند و آسیب‌های فراوانی را به ماکروملکول‌های بدن جانداران مانند DNA، پروتئین‌ها، لیپیدها و کربوهیدرات‌ها وارد می‌کنند. در بدن سیستم‌های خاصی برای مقابله با آسیب‌های حاصل از رادیکال‌های آزاد وجود دارد که به نام سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی معروف‌اند. زمانی که نبود تعادل در میزان تولید رادیکال‌های آزاد و سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی پیش آید، این حالت را استرس اکسیداتیو گویند. مهم‌ترین و فراوان‌ترین رادیکال‌ها، رادیکال‌های آزاد اکسیژن به‌ویژه رادیکال سوپراکسید (O2-) و رادیکال هیدروکسیل (HO) هستند. در بین رادیکال‌های آزاد نیتروژن نیز، نیتریک اکساید (NO) از بقیه مهم‌تر است [2].
پریتونیت عبارت است از تورم لایه سروزی که کف حفره شکم و احشا را مفروش می‌کند. حفره صفاق استریل و سترون است و هنگامی که عفونت (در اثر عواملی مانند سوراخ شدن روده و یا آپاندیس و یا کلون در اثر دیورتیکولیت) از محیط اطراف به آن وارد شود ایجاد پریتونیت می‌کند. همچنین، چنانچه مواد شیمیایی تحریک‌کننده مانند اسید معده و یا صفرا از طریق سوراخ شدن زخم معده، دوازدهه یا صفرا از طریق پارگی کبـد بـه آن راه یابـد، ایجـاد تـورم در صـفاق می‌کنند. عفونت‌های داخل صفاقی قبل از اواخر دهه دوم قرن بیستم تا بیش از 90 درصد مرگ‌و‌میرها را سبب می‌شد و پس از آن با متداول شدن عمل جراحی به کمتر از 40 درصد تقلیل یافت. درمان پریتونیت‌ها با در نظر گرفتن علت ایجاد‌کننده، کمی متفاوت است اما همیشه درمان بر سه اصل اساسی استوار است که عبارت‌اند از: تصحیح علت به‌وجودآورنده پریتونیت، استفاده از آنتی‌بیوتیک و درمان‌های نگهدارنده و کمک‌کننده برای محدود کردن عوارض آن. از آنجایی که مهم‌ترین علل پاتوفیزیولوژیک پریتونیت التهاب است [3]، استفاده از گیاهانی که باعث جمع‌آوری رادیکال‌های آزاد می‌شوند، به منزله گزینه‌ای برای درمان کمکی دارویی در این بیماری مطرح است [4].
گیاهان دارویی ویژگی‌هایی از قبیل در دسترس بودن، سمیت کمتر، هزینه کمتر و همچنین عوارض جانبی کمتر را دارند و می‌توانند همراه و هم جهت با طب کلاسیک برای کاهش علائم و کاهش الام بیماران مزمن استفاده شود. در ایران به علت تنوع آب‌و‌هوایی و شرایط جغرافیایی، انواع متعدد گیاهان رشد می‌کنند. این گیاهان عمدتاً به طور جداگانه یا در ترکیب با یکدیگر استفاده می‌شوند [5].
گیاه سیاه‌دانه از خانواده آلاله است و در ایران به‌ویژه در اراک و اصفهان به فراوانی می‌روید. دانه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌دهد و حاوی 30 تا 40 درصد روغن و 0/5 تا 1/5 درصد اسانس است. ماده مؤثر در سیاه‌دانه را تیموکینون تشکیل می‌دهد که هم در اسانس و هم در روغن وجود دارد. فعالیت بیولوژیکی سیاه‌دانه عمدتاً به ترکیب اصلی بخش روغنی آن مربوط می‌شود که عمده آن تیموکینون (30 تا 48 درصد) است. نقش این ماده با اثرات آنتی‌اکسیدان و ضدالتهابی، در درمان بیماری‌های التهابی و خودایمنی، از جمله دیابت، آرتریت و آسم نشان داده شده است [6].
خارمریم با نام علمی Silybum marianum، گیاهی یک یا دو ساله از خانواده کاسنی‌هاست. میوه این گیاه به شکل فندقه است. میوه‌های فندقه‌ای گیاه بخش دارویی آن را تشکیل می‌دهد. ترکیبات مؤثر اصلی میوه خارمریم از گروه فلاوونولیگنان‌ها با نام سیلیمارین است و این گیاه حداقل 1 درصد سیلیمارین دارد. سیلیمارین به مخلوطی از فلاوونولیگنان‌ها اطلاق می‌شود که شامل: سیلی بین، سیلی کریستین و سیلی دیانین است؛ قسمت عمده این مخلوط را سیلی بین تشکیل می‌دهد. در مطالعات اخیر اثرات درمانی این گیاه در بهبود کبد چرب، سیروز کبدی، دیابت، پوکی استخوان و سرطان نشان داده شده است [9 ,8, 7]. از محاسن فراورده‌های این گیاه سمیت نبودن آن است. همچنین در طب ایرانی به منزله یک ضدالتهاب وآنتی‌اکسیدان کاربرد داشته و در درمان بیماری‌هایی التهابی مؤثر بوده است [10، 11]. با توجه به اثر آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی این گیاهان و اینکه قدرت آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی ترکیب این دو عصاره بر مدل پریتونیت بررسی نشده است، ما بر آن شدیم تا درباره اثر ترکیب این دو گیاه را پژوهش کنیم.
مواد و روش‌ها
تهیه گیاهان
ابتدا گیاهان خارمریم و سیاه‌دانه از مراکز معتبر تهیه شد و پس از تأیید متخصص مربوطه، خارمریم با شماره هرباریوم HVN-IM-SMI3967 و سیاه‌دانه با شماره هرباریوم HVN-IM-NS13968 به ثبت رسیدند.
عصاره‌گیری
پس از تهیه گیاهان خارمریم و سیاه‌دانه از مراکز معتبر، عصاره متانولی خارمریم به روش سوکسله (Soxhlet; Heidolph, Germany) تهیه شد. قسمت فندقه گیاه با آسیاب به صورت کامل پودر شد و 30 گرم از پودر حاصل درون قیف در سوکسله با 75 میلی‌لیتر ان هگزان (Merck, Germany) به مدت 6 ساعت روغن‌گیری شد و سپس پودر فاقد چربی به مدت 5 ساعت با 75 میلی‌لیتر متانول خالص در سوکسله عصاره‌گیری شد. عصاره به‌دست‌آمده با استفاده از قیف بوخنر در سه مرحله فیلتر شد و در انتها با استفاده از تبخیرکننده دوار (Rotary evaporator; Heidolph, Germany) در دمای 35 درجه به مدت 50 دقیقه تغلیظ و در فور 40 درجه خشک شد [12]. برای عصاره‌گیری سیاه‌دانه نیز دانه‌ها با آسیاب به صورت کامل پودر شدند و عصاره‌گیری به روش شناخته‌شده سوکسله انجام شد. برای این منظور 60 گرم پودر دانه با 350 میلی‌لیتر اتانول 96 درصد عصاره‌گیری شد. عصاره به‌دست‌آمده با استفاده از قیف بوخنر در سه مرحله فیلتر شد و در انتها با استفاده از تبخیرکننده دوار در دمای 60 درجه به مدت 40 دقیقه تغلیظ و در فور 37 درجه خشک شد [13]. سپس پودرهای به‌دست‌آمده در DMSO (حلال) با غلظت 100 میلی‌گرم / میلی‌لیتر به شکل استوک تهیه و در منهای 70 درجه نگهداری شد.
تیمار حیوان آزمایشگاهی با عصاره‌ها
در این پروژه 30 سر موش نر نژاد Balb/C با وزن حدود 20 گرم و سن 8 هفته از انیستو پاستور تهیه شد و قبل از انجام هر آزمایش برای تطبیق شرایط محیطی موش‌ها به مدت یک هفته در آزمایشگاه پرورش حیوانات نگهداری شدند.
تست سمیت حاد (Acute toxicity)
طبق دستورالعمل OECD برای سنجش سمیت حاد، موش‌ها به پنج گروه شش‌تایی تقسیم شده و هر گروه در یک قفس نگهداری شد. عصاره‌ها نیز در DMSO حل شدند؛ DMSO ماده سمی و توکسیک است، به همین دلیل عصاره‌ها در 30 درصد از DMSO حل شدند که بر طبق مطالعات قبلی این مقدار از دی متیل سولفوکساید اثر سمی ندارد [14]. گروه اول موش‌ها برای کنترل (گروه شم) روزانه 20 میکرولیتر به صورت گاواژ (برای حذف اثر استرس گاواژها) DMSO 30 درصد دریافت کردند. به گروه دوم (گروه کنترل مثبت) طبق مطالعات قبلی 0/15 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم دگزامتازون به صورت داخل صفاقی تزریق شد [15]. گروه سوم و چهارم نیز بر اساس مطالعات قبلی با دُز mg/kg 2000 با عصاره‌های خارمریم و سیاه‌دانه گاواژ شدند [16, 17]. برای گروه پنجم نیز با ترکیب دو عصاره به نسبت 1/1 به مدت 14 روز گاواژ صورت گرفت. همچنین روزانه (به مدت 14 روز) از نظر مرگ‌ومیر، تغییرات وزن، الگوی رفتاری، علائم بیماری (لرزش، تشنج، اسهال و رخوت)، ظاهر فیزیکی، تغییر در تنفس و صدای تنفس پایش شدند. وزن موش‌ها سه بار در هفته تا پایان مطالعه اندازه‌گیری شد [18].
القای پریتونیت حاد در مدل موشی
تیمار با عصاره‌ها در این مطالعه به مدت 14 روز انجام شد که برای القای پریتونیت، روز دهم، چهار روز قبل از اتمام مراحل درمان، دریافت عصاره‌ها (1 میلی‌لیتر تایوگلیکولات 3 درصد؛ Sigma, USA؛ 3 گرم پودر تایوگلیکولات + 100میلی‌لیتر آب مقطر) به صورت داخل صفاقی تزریق شد؛ تزریق تایوگلیکولات برای جمع شدن ماکروفاژها در داخل صفاق و ایجاد پریتونیت انجام شد [19].
کشتن موش‌ها و خون‌گیری از قلب
12 تا 24 ساعت پس از آخرین گاواژ، موش‌ها با محلول کتامین زایلازین (Sigma, USA) بیهوش شدند، خون‌گیری از حیوانات به روش مستقیم از قلب انجام پذیرفت و برای جداسازی سرم، خون گرفته‌شده به مدت 5 دقیقه در g 2000 سانتریفیوژ شد.
بررسی سمیت عصاره‌های مذکور بر لنفوسیت‌های طحالی موش‌ها
در این راستا، پس از خارج کردن طحال در شرایط استریل از موش سالم، سلول‌های طحالی به روش مکانیکی با استفاده از فیلتر (Mesh) با قطر 0/7 میکرومتر (SPL, South Korea) استخراج شده و با استفاده از فایکول، لایه حاوی بافی کوت و لنفوسیت‌ها به دقت از گلبول‌های قرمز جدا شد. سپس لنفوسیت‌ها شمارش شده و به تعداد 100 هزار سلول در چاهک پلیت کشت 96 خانه برای بررسی سمیت عصاره‌ها با تست MTT کشت داده شد. سلول‌ها با غلظت‌های مشخص عصاره‌ها، هریک به صورت جداگانه و توأم مجاور شدند؛ پس از 4 ساعت انکوباسیون چاهک‌های مشخص‌شده، با LPS به مقدار 1 میکروگرم در میلی‌لیتر حساس شده و پس از 24 ساعت انکوباسیون نهایی دی متیل سولفوکساید اضافه شد. بعد از انکوباسیون در تاریکی جذب نوری با استفاده از دستگاه الایزا ریدر مورد سنجش قرار گرفت.
سنجش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم با روش FRAP
FRAP روشی برای اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی است. دراین روش Fe3+ در اثر خاصیت آنتی‌اکسیدانی نمونه به Fe2+ تبدیل و به رنگ آبی مشاهده می‌شود. این روش بر اساس توانایی سرم در احیای یون‌های Fe3+ (فریک) به Fe2+ (فرو) در حضور ماده‌ای به نام TPTZ استوار است. TPTZ- Fe2+ کمپلکس آبی رنگی با ماکزیمم جذب 593 نانومتر است که میزان قدرت احیاکنندگی سرم از طریق افزایش غلظت کمپلکس فوق اندازه‌گیری می‌شود [20]. در این پژوهش ابتدا محلول‌های استاندارد یون آهن تهیه شد و با محلول کار FRAP که شامل محلول تری پیریدیل تریازین، کلرو آهن و بافر استات است، مخلوط شد و طبق روش استاندارد جذب آن‌ها با استفاده از دستگاه الایزاریدر مدل Stat Fax ساخت کشور آلمان خوانش شد و در نهایت منحنی استاندارد مربوط به آن رسم شد. در ادامه طبق دستورالعمل استاندارد، هریک از نمونه‌ها با محلول کار FRAP مخلوط و جذب آن در 593 نانومتر خوانش شد. با تعیین جذب نمونه‌ها و با استفاده از منحنی استاندارد، ظرفیت کلی آنتی‌اکسیدانی سرمی خون بر مبنای غلظت یون فرو بر حسب میکرومول در لیتر مشخص شد.
اندازه‌گیری غلظت نیتریک اکسید در سرم به روش Griess
نیتریک اکسید (NO) یکی از عوامل مهم فیزیولوژیک و مؤثر در برخی سیستم‌های بیولوژیک از جمله سیستم ایمنی است و از این جهت سنجش غلظت آن در بافت‌ها و مایعات بیولوژیک ارزشمند قلمداد می‌شود. یکی از روش‌های سنجش NO، اندازه‌گیری غلظت نیتریت است که اساس این روش بر واکنش diazotization استوار شده است. در این روش نیتریت موجود در نمونه با سولفانیل آمید واکنش داده و در حضور N-1- نفتیل اتیلن دی آمین دی هیدروکلراید (NED) در شرایط اسیدی فسفریک اسید باعث ایجاد ترکیب به رنگ ارغوانی می‌شود [21]. سنجش نیترِیک اکساید توسط واکنش گریس به روش میکروپلیتی انجام شد. برای اندازه‌گیری غلظت نیتریت و نیترات (NOx) تام، در یک میکروپلیت الایزا ابتدا 100 میکرولیتر محلول NED به 100 میکرولیتر سرم افزوده شد و پس از 30 دقیقه انکوباسیون در تاریکی 100 میکرولیتر سولفانامید اضافه و مجدداً به مدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. بعد از انجام واکنش و تشکیل رنگ، جذب نوری حاصل از تشکیل ماده رنگی در 540 نانومتر با استفاده از دستگاه خوانشگر الایزا (Stat Fax) قرائت شد و بـا اسـتفاده از منحنی استاندارد غلظت نمونه‌ها محاسبه شد.
یافته‌ها
بررسی و مقایسه میانگین وزنی در موش‌های درمان‌شده با عصاره‌ها
همان‌طور که در تصویر شماره 1 نشان داده شده است، تغییر معناداری در وزن موش‌ها در دوره مطالعه بین گروه‌های درمانی و کنترل مشاهده نشده است.
التهاب نقش کلیدی در پاتوژنز بسیاری از بیماری‌ها از جمله پریتونیت را ایفا می‌کند. در این میان رادیکال‌های آزاد اکسیژن و نیتروژن جایگاه ویژه‌ای در مدیریت التهاب دارند [1]. رادیکال‌های آزاد به علت وجود الکترون تک، دائماً در بدن در حال گردش هستند و آسیب‌های فراوانی را به ماکروملکول‌های بدن جانداران مانند DNA، پروتئین‌ها، لیپیدها و کربوهیدرات‌ها وارد می‌کنند. در بدن سیستم‌های خاصی برای مقابله با آسیب‌های حاصل از رادیکال‌های آزاد وجود دارد که به نام سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی معروف‌اند. زمانی که نبود تعادل در میزان تولید رادیکال‌های آزاد و سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی پیش آید، این حالت را استرس اکسیداتیو گویند. مهم‌ترین و فراوان‌ترین رادیکال‌ها، رادیکال‌های آزاد اکسیژن به‌ویژه رادیکال سوپراکسید (O2-) و رادیکال هیدروکسیل (HO) هستند. در بین رادیکال‌های آزاد نیتروژن نیز، نیتریک اکساید (NO) از بقیه مهم‌تر است [2].
پریتونیت عبارت است از تورم لایه سروزی که کف حفره شکم و احشا را مفروش می‌کند. حفره صفاق استریل و سترون است و هنگامی که عفونت (در اثر عواملی مانند سوراخ شدن روده و یا آپاندیس و یا کلون در اثر دیورتیکولیت) از محیط اطراف به آن وارد شود ایجاد پریتونیت می‌کند. همچنین، چنانچه مواد شیمیایی تحریک‌کننده مانند اسید معده و یا صفرا از طریق سوراخ شدن زخم معده، دوازدهه یا صفرا از طریق پارگی کبـد بـه آن راه یابـد، ایجـاد تـورم در صـفاق می‌کنند. عفونت‌های داخل صفاقی قبل از اواخر دهه دوم قرن بیستم تا بیش از 90 درصد مرگ‌و‌میرها را سبب می‌شد و پس از آن با متداول شدن عمل جراحی به کمتر از 40 درصد تقلیل یافت. درمان پریتونیت‌ها با در نظر گرفتن علت ایجاد‌کننده، کمی متفاوت است اما همیشه درمان بر سه اصل اساسی استوار است که عبارت‌اند از: تصحیح علت به‌وجودآورنده پریتونیت، استفاده از آنتی‌بیوتیک و درمان‌های نگهدارنده و کمک‌کننده برای محدود کردن عوارض آن. از آنجایی که مهم‌ترین علل پاتوفیزیولوژیک پریتونیت التهاب است [3]، استفاده از گیاهانی که باعث جمع‌آوری رادیکال‌های آزاد می‌شوند، به منزله گزینه‌ای برای درمان کمکی دارویی در این بیماری مطرح است [4].
گیاهان دارویی ویژگی‌هایی از قبیل در دسترس بودن، سمیت کمتر، هزینه کمتر و همچنین عوارض جانبی کمتر را دارند و می‌توانند همراه و هم جهت با طب کلاسیک برای کاهش علائم و کاهش الام بیماران مزمن استفاده شود. در ایران به علت تنوع آب‌و‌هوایی و شرایط جغرافیایی، انواع متعدد گیاهان رشد می‌کنند. این گیاهان عمدتاً به طور جداگانه یا در ترکیب با یکدیگر استفاده می‌شوند [5].
گیاه سیاه‌دانه از خانواده آلاله است و در ایران به‌ویژه در اراک و اصفهان به فراوانی می‌روید. دانه بخش دارویی این گیاه را تشکیل می‌دهد و حاوی 30 تا 40 درصد روغن و 0/5 تا 1/5 درصد اسانس است. ماده مؤثر در سیاه‌دانه را تیموکینون تشکیل می‌دهد که هم در اسانس و هم در روغن وجود دارد. فعالیت بیولوژیکی سیاه‌دانه عمدتاً به ترکیب اصلی بخش روغنی آن مربوط می‌شود که عمده آن تیموکینون (30 تا 48 درصد) است. نقش این ماده با اثرات آنتی‌اکسیدان و ضدالتهابی، در درمان بیماری‌های التهابی و خودایمنی، از جمله دیابت، آرتریت و آسم نشان داده شده است [6].
خارمریم با نام علمی Silybum marianum، گیاهی یک یا دو ساله از خانواده کاسنی‌هاست. میوه این گیاه به شکل فندقه است. میوه‌های فندقه‌ای گیاه بخش دارویی آن را تشکیل می‌دهد. ترکیبات مؤثر اصلی میوه خارمریم از گروه فلاوونولیگنان‌ها با نام سیلیمارین است و این گیاه حداقل 1 درصد سیلیمارین دارد. سیلیمارین به مخلوطی از فلاوونولیگنان‌ها اطلاق می‌شود که شامل: سیلی بین، سیلی کریستین و سیلی دیانین است؛ قسمت عمده این مخلوط را سیلی بین تشکیل می‌دهد. در مطالعات اخیر اثرات درمانی این گیاه در بهبود کبد چرب، سیروز کبدی، دیابت، پوکی استخوان و سرطان نشان داده شده است [9 ,8, 7]. از محاسن فراورده‌های این گیاه سمیت نبودن آن است. همچنین در طب ایرانی به منزله یک ضدالتهاب وآنتی‌اکسیدان کاربرد داشته و در درمان بیماری‌هایی التهابی مؤثر بوده است [10، 11]. با توجه به اثر آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی این گیاهان و اینکه قدرت آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی ترکیب این دو عصاره بر مدل پریتونیت بررسی نشده است، ما بر آن شدیم تا درباره اثر ترکیب این دو گیاه را پژوهش کنیم.
مواد و روش‌ها
تهیه گیاهان
ابتدا گیاهان خارمریم و سیاه‌دانه از مراکز معتبر تهیه شد و پس از تأیید متخصص مربوطه، خارمریم با شماره هرباریوم HVN-IM-SMI3967 و سیاه‌دانه با شماره هرباریوم HVN-IM-NS13968 به ثبت رسیدند.
عصاره‌گیری
پس از تهیه گیاهان خارمریم و سیاه‌دانه از مراکز معتبر، عصاره متانولی خارمریم به روش سوکسله (Soxhlet; Heidolph, Germany) تهیه شد. قسمت فندقه گیاه با آسیاب به صورت کامل پودر شد و 30 گرم از پودر حاصل درون قیف در سوکسله با 75 میلی‌لیتر ان هگزان (Merck, Germany) به مدت 6 ساعت روغن‌گیری شد و سپس پودر فاقد چربی به مدت 5 ساعت با 75 میلی‌لیتر متانول خالص در سوکسله عصاره‌گیری شد. عصاره به‌دست‌آمده با استفاده از قیف بوخنر در سه مرحله فیلتر شد و در انتها با استفاده از تبخیرکننده دوار (Rotary evaporator; Heidolph, Germany) در دمای 35 درجه به مدت 50 دقیقه تغلیظ و در فور 40 درجه خشک شد [12]. برای عصاره‌گیری سیاه‌دانه نیز دانه‌ها با آسیاب به صورت کامل پودر شدند و عصاره‌گیری به روش شناخته‌شده سوکسله انجام شد. برای این منظور 60 گرم پودر دانه با 350 میلی‌لیتر اتانول 96 درصد عصاره‌گیری شد. عصاره به‌دست‌آمده با استفاده از قیف بوخنر در سه مرحله فیلتر شد و در انتها با استفاده از تبخیرکننده دوار در دمای 60 درجه به مدت 40 دقیقه تغلیظ و در فور 37 درجه خشک شد [13]. سپس پودرهای به‌دست‌آمده در DMSO (حلال) با غلظت 100 میلی‌گرم / میلی‌لیتر به شکل استوک تهیه و در منهای 70 درجه نگهداری شد.
تیمار حیوان آزمایشگاهی با عصاره‌ها
در این پروژه 30 سر موش نر نژاد Balb/C با وزن حدود 20 گرم و سن 8 هفته از انیستو پاستور تهیه شد و قبل از انجام هر آزمایش برای تطبیق شرایط محیطی موش‌ها به مدت یک هفته در آزمایشگاه پرورش حیوانات نگهداری شدند.
تست سمیت حاد (Acute toxicity)
طبق دستورالعمل OECD برای سنجش سمیت حاد، موش‌ها به پنج گروه شش‌تایی تقسیم شده و هر گروه در یک قفس نگهداری شد. عصاره‌ها نیز در DMSO حل شدند؛ DMSO ماده سمی و توکسیک است، به همین دلیل عصاره‌ها در 30 درصد از DMSO حل شدند که بر طبق مطالعات قبلی این مقدار از دی متیل سولفوکساید اثر سمی ندارد [14]. گروه اول موش‌ها برای کنترل (گروه شم) روزانه 20 میکرولیتر به صورت گاواژ (برای حذف اثر استرس گاواژها) DMSO 30 درصد دریافت کردند. به گروه دوم (گروه کنترل مثبت) طبق مطالعات قبلی 0/15 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم دگزامتازون به صورت داخل صفاقی تزریق شد [15]. گروه سوم و چهارم نیز بر اساس مطالعات قبلی با دُز mg/kg 2000 با عصاره‌های خارمریم و سیاه‌دانه گاواژ شدند [16, 17]. برای گروه پنجم نیز با ترکیب دو عصاره به نسبت 1/1 به مدت 14 روز گاواژ صورت گرفت. همچنین روزانه (به مدت 14 روز) از نظر مرگ‌ومیر، تغییرات وزن، الگوی رفتاری، علائم بیماری (لرزش، تشنج، اسهال و رخوت)، ظاهر فیزیکی، تغییر در تنفس و صدای تنفس پایش شدند. وزن موش‌ها سه بار در هفته تا پایان مطالعه اندازه‌گیری شد [18].
القای پریتونیت حاد در مدل موشی
تیمار با عصاره‌ها در این مطالعه به مدت 14 روز انجام شد که برای القای پریتونیت، روز دهم، چهار روز قبل از اتمام مراحل درمان، دریافت عصاره‌ها (1 میلی‌لیتر تایوگلیکولات 3 درصد؛ Sigma, USA؛ 3 گرم پودر تایوگلیکولات + 100میلی‌لیتر آب مقطر) به صورت داخل صفاقی تزریق شد؛ تزریق تایوگلیکولات برای جمع شدن ماکروفاژها در داخل صفاق و ایجاد پریتونیت انجام شد [19].
کشتن موش‌ها و خون‌گیری از قلب
12 تا 24 ساعت پس از آخرین گاواژ، موش‌ها با محلول کتامین زایلازین (Sigma, USA) بیهوش شدند، خون‌گیری از حیوانات به روش مستقیم از قلب انجام پذیرفت و برای جداسازی سرم، خون گرفته‌شده به مدت 5 دقیقه در g 2000 سانتریفیوژ شد.
بررسی سمیت عصاره‌های مذکور بر لنفوسیت‌های طحالی موش‌ها
در این راستا، پس از خارج کردن طحال در شرایط استریل از موش سالم، سلول‌های طحالی به روش مکانیکی با استفاده از فیلتر (Mesh) با قطر 0/7 میکرومتر (SPL, South Korea) استخراج شده و با استفاده از فایکول، لایه حاوی بافی کوت و لنفوسیت‌ها به دقت از گلبول‌های قرمز جدا شد. سپس لنفوسیت‌ها شمارش شده و به تعداد 100 هزار سلول در چاهک پلیت کشت 96 خانه برای بررسی سمیت عصاره‌ها با تست MTT کشت داده شد. سلول‌ها با غلظت‌های مشخص عصاره‌ها، هریک به صورت جداگانه و توأم مجاور شدند؛ پس از 4 ساعت انکوباسیون چاهک‌های مشخص‌شده، با LPS به مقدار 1 میکروگرم در میلی‌لیتر حساس شده و پس از 24 ساعت انکوباسیون نهایی دی متیل سولفوکساید اضافه شد. بعد از انکوباسیون در تاریکی جذب نوری با استفاده از دستگاه الایزا ریدر مورد سنجش قرار گرفت.
سنجش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی تام سرم با روش FRAP
FRAP روشی برای اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانی است. دراین روش Fe3+ در اثر خاصیت آنتی‌اکسیدانی نمونه به Fe2+ تبدیل و به رنگ آبی مشاهده می‌شود. این روش بر اساس توانایی سرم در احیای یون‌های Fe3+ (فریک) به Fe2+ (فرو) در حضور ماده‌ای به نام TPTZ استوار است. TPTZ- Fe2+ کمپلکس آبی رنگی با ماکزیمم جذب 593 نانومتر است که میزان قدرت احیاکنندگی سرم از طریق افزایش غلظت کمپلکس فوق اندازه‌گیری می‌شود [20]. در این پژوهش ابتدا محلول‌های استاندارد یون آهن تهیه شد و با محلول کار FRAP که شامل محلول تری پیریدیل تریازین، کلرو آهن و بافر استات است، مخلوط شد و طبق روش استاندارد جذب آن‌ها با استفاده از دستگاه الایزاریدر مدل Stat Fax ساخت کشور آلمان خوانش شد و در نهایت منحنی استاندارد مربوط به آن رسم شد. در ادامه طبق دستورالعمل استاندارد، هریک از نمونه‌ها با محلول کار FRAP مخلوط و جذب آن در 593 نانومتر خوانش شد. با تعیین جذب نمونه‌ها و با استفاده از منحنی استاندارد، ظرفیت کلی آنتی‌اکسیدانی سرمی خون بر مبنای غلظت یون فرو بر حسب میکرومول در لیتر مشخص شد.
اندازه‌گیری غلظت نیتریک اکسید در سرم به روش Griess
نیتریک اکسید (NO) یکی از عوامل مهم فیزیولوژیک و مؤثر در برخی سیستم‌های بیولوژیک از جمله سیستم ایمنی است و از این جهت سنجش غلظت آن در بافت‌ها و مایعات بیولوژیک ارزشمند قلمداد می‌شود. یکی از روش‌های سنجش NO، اندازه‌گیری غلظت نیتریت است که اساس این روش بر واکنش diazotization استوار شده است. در این روش نیتریت موجود در نمونه با سولفانیل آمید واکنش داده و در حضور N-1- نفتیل اتیلن دی آمین دی هیدروکلراید (NED) در شرایط اسیدی فسفریک اسید باعث ایجاد ترکیب به رنگ ارغوانی می‌شود [21]. سنجش نیترِیک اکساید توسط واکنش گریس به روش میکروپلیتی انجام شد. برای اندازه‌گیری غلظت نیتریت و نیترات (NOx) تام، در یک میکروپلیت الایزا ابتدا 100 میکرولیتر محلول NED به 100 میکرولیتر سرم افزوده شد و پس از 30 دقیقه انکوباسیون در تاریکی 100 میکرولیتر سولفانامید اضافه و مجدداً به مدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. بعد از انجام واکنش و تشکیل رنگ، جذب نوری حاصل از تشکیل ماده رنگی در 540 نانومتر با استفاده از دستگاه خوانشگر الایزا (Stat Fax) قرائت شد و بـا اسـتفاده از منحنی استاندارد غلظت نمونه‌ها محاسبه شد.
یافته‌ها
بررسی و مقایسه میانگین وزنی در موش‌های درمان‌شده با عصاره‌ها
همان‌طور که در تصویر شماره 1 نشان داده شده است، تغییر معناداری در وزن موش‌ها در دوره مطالعه بین گروه‌های درمانی و کنترل مشاهده نشده است.
.jpg)
همچنین، هیچ‌گونه تغییر رفتار و یا نشانه کلینیکال مسمومیت مانند کاهش آب و غذا و مشکلات گوارشی در موش‌های در معرض درمان با هریک از عصاره‌های مذکور در طول 14 روز نشان داده نشد.
بررسی اثر سمیت عصاره‌ها بر سلول‌های طحالی موش
برای بررسی سمیت عصاره‌های مذکور نیز درصد حیات سلولی در لنفوسیت‌های طحالی بررسی شد. همان طور که در تصویر شماره 2 مشخص است، هیچ‌گونه کاهش معنادار در درصد حیات سلول‌های لنفوسیتی مشاهده نمی‌شود.
بررسی اثر سمیت عصاره‌ها بر سلول‌های طحالی موش
برای بررسی سمیت عصاره‌های مذکور نیز درصد حیات سلولی در لنفوسیت‌های طحالی بررسی شد. همان طور که در تصویر شماره 2 مشخص است، هیچ‌گونه کاهش معنادار در درصد حیات سلول‌های لنفوسیتی مشاهده نمی‌شود.
.jpg)
بررسی تأثیر عصاره‌ها بر میزان نیتریک اکساید تولیدی در سرم موش‌های گاواژشده
میزان تولید نیتریت در سرم موش‌های گاواژشده با عصاره‌های خارمریم، سیاه‌دانه و ترکیب این دو عصاره بررسی شد. به طور شگفت‌انگیزی هریک از عصاره‌ها به‌تنهایی و در ترکیب با یکدیگر باعث کاهش معنادار سطح سرمی نیتریت در مقایسه با گروه کنترل شده است (تصویر شماره 3).
میزان تولید نیتریت در سرم موش‌های گاواژشده با عصاره‌های خارمریم، سیاه‌دانه و ترکیب این دو عصاره بررسی شد. به طور شگفت‌انگیزی هریک از عصاره‌ها به‌تنهایی و در ترکیب با یکدیگر باعث کاهش معنادار سطح سرمی نیتریت در مقایسه با گروه کنترل شده است (تصویر شماره 3).
.jpg)
مقایسه فعالیت آنتی‌اکسیدانی سرم بین گروه‌های درمانی
پتانسیل آنتی‌اکسیدانی عصاره خارمریم، سیاه‌دانه و ترکیب این دو عصاره در تست FRAP بررسی و مقایسه شد. همان طور که در تصویر شماره 4 مشاهده می‌شود، افزایش معناداری در گروه توأم در مقایسه با کنترل، سیاه‌دانه و خارمریم مشاهده شد.
پتانسیل آنتی‌اکسیدانی عصاره خارمریم، سیاه‌دانه و ترکیب این دو عصاره در تست FRAP بررسی و مقایسه شد. همان طور که در تصویر شماره 4 مشاهده می‌شود، افزایش معناداری در گروه توأم در مقایسه با کنترل، سیاه‌دانه و خارمریم مشاهده شد.
.jpg)
بحث
یافتن یک عامل تأثیرگذار مانند استفاده از عصاره‌های گیاهی که منجر به کاهش التهاب همراه با اثر آنتی‌اکسیدانی خود می‌شود، می‌تواند یک درمان مکمل و حمایتی مؤثر در بیماری‌های التهابی از جمله پریتونیت باشد. شواهد قبلی خاصیت ضدالتهابی و اثرات آنتی‌اکسیدانی هریک از عصاره‌های سیاه‌دانه و خارمریم را نشان دادند [22]. در این مطالعه خواص آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی ترکیب عصاره‌های سیاه‌دانه و خارمریم در مدل پریتونیت القاشده با تایوگلیکولات مطالعه شد.
عصاره‌های گیاهان سیاه‌دانه و خارمریم در غلظت 50 تا 800 میکروگرم در میلی‌لیتر، فاقد اثرات سمی بر لنفوسیت‌های طحالی در بودن و نبودن LPS بود. نتایج تست سمیت حاد نیز بی‌خطر بودن دُزهای تجویزشده برای موش‌ها را نشان داد. از این رو اثرات مهاری عصاره‌های مذکور بر التهاب به علت اثر توکسیک و در پی آن، کشته شدن سلول‌ها نبوده است [23, 24]. هم‌راستا با مطالعه ما، نبود سمیت حاد و مزمن خارمریم و عصاره روغنی سیاه‌دانه بر حیوانات آزمایشگاهی حتی با دُزهای بیشتر از این مطالعه نشان داده شد [25, 26].
چنین به نظر می‌رسد که افزایش معنی‌دار قدرت آنتی‌اکسیدانی ترکیب این دو عصاره در برابر هریک از این عصاره‌ها و گروه کنترل بیان‌کننده اثر سینرژیسمی عناصر گوناگون و شرکت همه فلاونوئید‌ها در قدرت آنتی‌اکسیدانی عصاره باشد [27، 28]. در تأیید این هم‌گرایی نیز مطابق با موارد فوق روغن خام سیاه‌دانه و فراکسیون‌های آن (لیپیدهای خنثی، گلیکولیپیدها و فسفولیپیدها) فعالیت آنتی‌اکسیدانی از خود نشان دادند که به‌خوبی با کل محتوای آن‌ها ارتباط دارد [29]. در مطالعه دیگری، قدرت آنتی‌اکسیدانی روغن دانه سیاه‌دانه و روغن دانه خارمریم با سه تست متفاوت به یک اندازه گزارش شده است [27]. شاهین و همکاران نشان دادند، سیاه‌دانه دارای اثر آنتی‌اکسیدانی بیشتری نسبت به خارمریم است [30]. این تفاوت می‌تواند به سبب متفاوت بودن حلّال استفاده‌شده در عصاره‌گیری و تأییدکننده نقش حلال‌های الکلی در قدرت آنتی‌اکسیدانی باشد.
با توجه به آزاد شدن واسطه‌های التهابی در التهاب حاد به خصوص نیتریک اکساید، طبق داده‌ها می‌توان نتیجه گرفت عصاره گیاهان مذکور به مقدار معنی‌داری از آزاد شدن این واسطه جلوگیری کرده است. همچنین در گروه ترکیب دو عصاره مذکور اثراتی مشابه دگزامتازون در کاهش نیتریک اکساید دیده شد. در تأیید این مسئله نشان داده شد که درمان ماکروفاژهای صفاقی استخراج‌شده با تیوگلیکولات و مجاورشده با LPS و IFNγ با عصاره آبی سیاه‌دانه منجر به سرکوب واسطه‌های اصلی التهاب مانند NO شده است [24]. در این ارتباط نیز اثر مواد مؤثر عصاره‌های خارمریم و سیاه‌دانه که به ترتیب سیلیمارین و تیموکینون است بر میزان تولید نیتریک اکساید بررسی شده است. اثر ضدالتهابی تیموکینون در مدل التهابی آرتریت رماتوئید ایجادشده با کلاژن در موش، همراه با کاهش نیتریک اکساید می‌تواند مؤید اثر ضدالتهابی این گیاه باشد [31]. همچنین عصاره خارمریم نیز در این مطالعه باعث کاهش نیتریک اکساید شده است که هم‌راستا با اثرات ضدالتهابی ماده مؤثر در مطالعات گذشته بوده است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که سیلیبین با مسدود کردن مسیرهای سیگنالینگ یا NF-κB و مهار تولید نیتریک اکساید، منجر به مهار فعالیت ماکروفاژهای صفاقی موش می‌شود [32]. در مطالعه حاضر اثر توأم عصاره‌های مذکور در کاهش چشمگیر نیتریک اکساید و افزایش معنادار آنتی‌اکسیدان در سرم موش‌ها نشان داده شد که تأییدی بر اثرات پلی هربالیسم و اثرات سینرژیسمی این دو گیاه است.
نتیجه‌گیری
با توجه به داده‌های آورده‌شده نتیجه گرفته می‌شود که فرضیه ما در ترکیب دو عصاره سیاه‌دانه و خارمریم و افزایش خاصیت آنتی‌اکسیدانی و مهار التهاب در مدل موشی پریتونیت قبول است. و ممکن است در جلوگیری از التهاب و مزمن شدن آن نقش داشته باشد و بتوان از آن به عنوان درمان مکمل در بیماری‌های التهابی استفاده کرد. در مورد چگونگی اثر گیاهان در میزان و مقدار آزاد شدن واسطه‌های التهابی درگیر باید تحقیقات ایمونولوژیک تکمیلی صورت گیرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی مرکز تحقیقات دانشگاه علوم‌پزشکی اراک همه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار روی حیوانات آزمایشگاهی را در این مطالعه تأیید کرده و این پژوهش با کد اخلاق IR.ARAKMU.REC.1397.359 تصویب شد.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پروژه تحقیقاتی با کد 3196 است و هزینه انجام آن را معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم‌پزشکی اراک تأمین کرده است.
مشارکت نویسندگان
تمامی نویسندگان به یک اندازه در نگارش مقاله مشارکت داشته‌اند.
تعارض منافع
طبق نظر نویسندگان هیچ‌گونه تضاد منافعی در پژوهش حاضر وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از معاونت تحقیقات و شورای پژوهشی دانشگاه علوم‌پزشکی اراک به دلیل تأمین مالی تشکر و قدردانی می‌شود.
یافتن یک عامل تأثیرگذار مانند استفاده از عصاره‌های گیاهی که منجر به کاهش التهاب همراه با اثر آنتی‌اکسیدانی خود می‌شود، می‌تواند یک درمان مکمل و حمایتی مؤثر در بیماری‌های التهابی از جمله پریتونیت باشد. شواهد قبلی خاصیت ضدالتهابی و اثرات آنتی‌اکسیدانی هریک از عصاره‌های سیاه‌دانه و خارمریم را نشان دادند [22]. در این مطالعه خواص آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی ترکیب عصاره‌های سیاه‌دانه و خارمریم در مدل پریتونیت القاشده با تایوگلیکولات مطالعه شد.
عصاره‌های گیاهان سیاه‌دانه و خارمریم در غلظت 50 تا 800 میکروگرم در میلی‌لیتر، فاقد اثرات سمی بر لنفوسیت‌های طحالی در بودن و نبودن LPS بود. نتایج تست سمیت حاد نیز بی‌خطر بودن دُزهای تجویزشده برای موش‌ها را نشان داد. از این رو اثرات مهاری عصاره‌های مذکور بر التهاب به علت اثر توکسیک و در پی آن، کشته شدن سلول‌ها نبوده است [23, 24]. هم‌راستا با مطالعه ما، نبود سمیت حاد و مزمن خارمریم و عصاره روغنی سیاه‌دانه بر حیوانات آزمایشگاهی حتی با دُزهای بیشتر از این مطالعه نشان داده شد [25, 26].
چنین به نظر می‌رسد که افزایش معنی‌دار قدرت آنتی‌اکسیدانی ترکیب این دو عصاره در برابر هریک از این عصاره‌ها و گروه کنترل بیان‌کننده اثر سینرژیسمی عناصر گوناگون و شرکت همه فلاونوئید‌ها در قدرت آنتی‌اکسیدانی عصاره باشد [27، 28]. در تأیید این هم‌گرایی نیز مطابق با موارد فوق روغن خام سیاه‌دانه و فراکسیون‌های آن (لیپیدهای خنثی، گلیکولیپیدها و فسفولیپیدها) فعالیت آنتی‌اکسیدانی از خود نشان دادند که به‌خوبی با کل محتوای آن‌ها ارتباط دارد [29]. در مطالعه دیگری، قدرت آنتی‌اکسیدانی روغن دانه سیاه‌دانه و روغن دانه خارمریم با سه تست متفاوت به یک اندازه گزارش شده است [27]. شاهین و همکاران نشان دادند، سیاه‌دانه دارای اثر آنتی‌اکسیدانی بیشتری نسبت به خارمریم است [30]. این تفاوت می‌تواند به سبب متفاوت بودن حلّال استفاده‌شده در عصاره‌گیری و تأییدکننده نقش حلال‌های الکلی در قدرت آنتی‌اکسیدانی باشد.
با توجه به آزاد شدن واسطه‌های التهابی در التهاب حاد به خصوص نیتریک اکساید، طبق داده‌ها می‌توان نتیجه گرفت عصاره گیاهان مذکور به مقدار معنی‌داری از آزاد شدن این واسطه جلوگیری کرده است. همچنین در گروه ترکیب دو عصاره مذکور اثراتی مشابه دگزامتازون در کاهش نیتریک اکساید دیده شد. در تأیید این مسئله نشان داده شد که درمان ماکروفاژهای صفاقی استخراج‌شده با تیوگلیکولات و مجاورشده با LPS و IFNγ با عصاره آبی سیاه‌دانه منجر به سرکوب واسطه‌های اصلی التهاب مانند NO شده است [24]. در این ارتباط نیز اثر مواد مؤثر عصاره‌های خارمریم و سیاه‌دانه که به ترتیب سیلیمارین و تیموکینون است بر میزان تولید نیتریک اکساید بررسی شده است. اثر ضدالتهابی تیموکینون در مدل التهابی آرتریت رماتوئید ایجادشده با کلاژن در موش، همراه با کاهش نیتریک اکساید می‌تواند مؤید اثر ضدالتهابی این گیاه باشد [31]. همچنین عصاره خارمریم نیز در این مطالعه باعث کاهش نیتریک اکساید شده است که هم‌راستا با اثرات ضدالتهابی ماده مؤثر در مطالعات گذشته بوده است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که سیلیبین با مسدود کردن مسیرهای سیگنالینگ یا NF-κB و مهار تولید نیتریک اکساید، منجر به مهار فعالیت ماکروفاژهای صفاقی موش می‌شود [32]. در مطالعه حاضر اثر توأم عصاره‌های مذکور در کاهش چشمگیر نیتریک اکساید و افزایش معنادار آنتی‌اکسیدان در سرم موش‌ها نشان داده شد که تأییدی بر اثرات پلی هربالیسم و اثرات سینرژیسمی این دو گیاه است.
نتیجه‌گیری
با توجه به داده‌های آورده‌شده نتیجه گرفته می‌شود که فرضیه ما در ترکیب دو عصاره سیاه‌دانه و خارمریم و افزایش خاصیت آنتی‌اکسیدانی و مهار التهاب در مدل موشی پریتونیت قبول است. و ممکن است در جلوگیری از التهاب و مزمن شدن آن نقش داشته باشد و بتوان از آن به عنوان درمان مکمل در بیماری‌های التهابی استفاده کرد. در مورد چگونگی اثر گیاهان در میزان و مقدار آزاد شدن واسطه‌های التهابی درگیر باید تحقیقات ایمونولوژیک تکمیلی صورت گیرد.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
کمیته نظارت بر حقوق حیوانات آزمایشگاهی مرکز تحقیقات دانشگاه علوم‌پزشکی اراک همه ملاحظات اخلاقی و پروتکل‌های کار روی حیوانات آزمایشگاهی را در این مطالعه تأیید کرده و این پژوهش با کد اخلاق IR.ARAKMU.REC.1397.359 تصویب شد.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پروژه تحقیقاتی با کد 3196 است و هزینه انجام آن را معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم‌پزشکی اراک تأمین کرده است.
مشارکت نویسندگان
تمامی نویسندگان به یک اندازه در نگارش مقاله مشارکت داشته‌اند.
تعارض منافع
طبق نظر نویسندگان هیچ‌گونه تضاد منافعی در پژوهش حاضر وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
بدین‌وسیله از معاونت تحقیقات و شورای پژوهشی دانشگاه علوم‌پزشکی اراک به دلیل تأمین مالی تشکر و قدردانی می‌شود.
References
1.Ganji A, Farahani I, Palizvan MR, Ghazavi A, Ejtehadifar M, Ebrahimimonfared M, et al. Therapeutic effects of walnut oil on the animal model of multiple sclerosis. Nutr Neurosci. 2019; 22(3):215-22.[DOI:10.1080/1028415X.2017.1371389]
2.Ghazavi A, Mosayebi G, Solhi H, Rafiei M, Moazzeni SM. Serum markers of inflammation and oxidative stress in chronic opium (Taryak) smokers. Immunol Lett. 2013; 153(1-2):22-6. [DOI:10.1016/j.imlet.2013.07.001]
3.Jones RS, Claridge JA. Acute abdomen. In: Townsend CM, Sabiston DC, editors. Sabiston Textbook of Surgery, 17th edition. Philadelphia: Elsevior SAounders; 2004. https://books.google.com/books?id=8b_IRwAACAAJ&dq
4.Mion CM, Béraud JJ. Treatment of acute renal failure by peritoneal dialysis. In Acute Renal Failure. Boston: Springer; 1984. https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4613-2841-4_24
5.Amirghofran Z. Medicinal plants as immunosuppressive agents in traditional Iranian medicine. Iran J Immunol. 2010; 7(2):65-73.[PMID]
6.Woo CC, Kumar AP, Sethi G, Tan KHB. Thymoquinone: Potential cure for inflammatory disorders and cancer. Biochem Pharmacol. 2012; 83(4):443-51. [DOI:10.1016/j.bcp.2011.09.029][PMID]
7.Lirussi F, Beccarello A, Zanette G, De Monte A, Donadon V, Velussi M, et al. Silybin-beta-cyclodextrin in the treatment of patients with diabetes mellitus and alcoholic liver disease. Efficacy study of a new preparation of an anti-oxidant agent. Diabetes Nutr Metab. 2002; 15(4):222-31. [PMID]
8.Agrawal S, Bonkovsky HL. Management of nonalcoholic steatohepatitis: An analytic review. J Clin Gastroenterol. 2002; 35(3):253-61.[DOI:10.1097/00004836-200209000-00011]
9.Lucena MI, Andrade RJ, de la Cruz JP, Rodriguez-Mendizabal M, Blanco E, de la Cuesta FS. Effects of silymarin MZ-80 on oxidative stress in patients with alcoholic cirrhosis. Int J Clin Pharmacol Ther. 2002; 40(1):2-8. [DOI:10.5414/CPP40002]
10.Tavakkoli A, Mahdian V, Razavi BM, Hosseinzadeh H. Review on clinical trials of black seed (Nigella sativa ) and its active constituent, thymoquinone. J Pharmacopuncture. 2017; 20(3):179-93. [DOI:10.3831/KPI.2017.20.021] [PMID] [PMCID]
11.Esmaeil N, Balouchi Anaraki S, Gharagozloo M, Moayedi B. Silymarin impacts on immune system as an immunomodulator: One key for many locks. Int Immunopharmacol. 2017; 50:194-201. [DOI:10.1016/j.intimp.2017.06.030]
12.Wianowska D, Wiśniewski M. Simplified procedure of silymarin extraction from silybum marianum L. Gaertner. J Chromatogr Sci. 2015; 53(2):366-72.[DOI:10.1093/chromsci/bmu049]
13.Koshak AE, Yousif NM, Fiebich BL, Koshak EA, Heinrich M. Comparative immunomodulatory activity of Nigella sativa l. preparations on proinflammatory mediators: A focus on asthma. Front Pharmacol. 2018; 9:1075. [PMID] [PMCID]
14.Noel PRB, Barnett KC, Davies RE, Jolly DW, Leahy JS, Mawdesley-E, et al. The toxicity of dimethyl sulphoxide (DMSO) for the dog, pig, rat and rabbit. Toxicol. 1975; 3(2):143-69. [DOI:10.1016/0300-483X(75)90081-5]
15.Xu T, Qiao J, Zhao L, He G, Li K, Wang J, et al. Effect of dexamethasone on acute respiratory distress syndrome induced by the H5N1 virus in mice. Eur Respir J. 2009; 33:852-60. [DOI:10.1183/09031936.00130507]
16.Vahdati-Mashhadian N, Rakhshandeh H, Omidi A. An investigation on LD50 and subacute hepatic toxicity of Nigella sativa seed extracts in mice. Int J Pharm Sci. 2005; 60(7):544-7. https://www.ingentaconnect.com/content/govi/pharmaz/2005/00000060/00000007/art00013
17.Soufy NI. Hepatoprotective and antioxidant effects of Silybum marianum plant against hepatotoxicity induced by carbon tetrachloride in rats. J Am Sci. 2012; 8(4):479-86. http://www.jofamericanscience.org/journals/am-sci/am0804/064_8482am0804_479_486.pdf
18.Kitano M. Updating of OECD guidelines for the testing of chemicals. Wat Sci Tech. 1992; 25(11):465-72. https://www.proquest.com/docview/1943169657
19.Lam D, Harris D, Qin Z. Inflammatory mediator profiling reveals immune properties of chemotactic gradients and macrophage mediator production inhibition during thioglycollate elicited peritoneal inflammation. Mediators Inflamm. 2013; 1-9. [DOI:10.1155/2013/931562]
20.Benzie IFF, Strain JJ. The Ferric Reducing Ability Of Plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: The FRAP assay. Anal Biochem. 1996; 239(1):70-6.[DOI:10.1006/abio.1996.0292]
21.Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem. 1982; 126(1):131-8. [DOI:10.1016/0003-2697(82)90118-X
22.Gholamnezhad Z, Keyhanmanesh R, Boskabady MH. Anti-inflammatory, antioxidant, and immunomodulatory aspects of Nigella sativa for its preventive and bronchodilatory effects on obstructive respiratory diseases: A review of basic and clinical evidence. J Funct Foods. 2015; 17:910-27. [DOI:10.1016/j.jff.2015.06.032]
23.Gharagozloo M, Jafari S, Esmaeil N, Javid EN, Bagherpour B, Rezaei A. Immunosuppressive effect of silymarin on mitogen-activated protein kinase signalling pathway: The impact on T cell proliferation and cytokine production. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2013; 113(3):209-14. [DOI:10.1111/bcpt.12088]
24.Majdalawieh AF, Hmaidan R, Carr RI. Nigella sativa modulates splenocyte proliferation, Th1/Th2 cytokine profile, macrophage function and NK anti-tumor activity. J Ethnopharmacol. 2010; 131(2):268-75. [DOI:10.1016/j.jep.2010.06.030]
25.Hajhashemi V, Ghannadi A, Jafarabadi H. Black cumin seed essential oil, as a potent analgesic and antiinflammatory drug. Phytother Res. 2004; 18(3):195-9. [DOI: 10.1002/ptr.1390]
26.Bahmani M, Shirzad H, Rafieian S, Rafieian-Kopaei M. Silybum marianum: Beyond hepatoprotection. J Evid Based Complementary Altern Med. 2015; 20(4):292-301. [DOI:10.1177/2156587215571116]
27.Meddeb W, Rezig L, Zarrouk A, Nury T, Vejux A, Prost M, et al. Cytoprotective activities of milk thistle seed oil used in traditional tunisian medicine on 7-ketocholesterol and 24s-hydroxycholesterol-induced toxicity on 158N murine oligodendrocytes. Antioxidants (Basel). 2018; 7(7):95. [DOI:10.3390/antiox7070095]
28.Anvari D, Jamei R. Evaluation of antioxidant capacity and phenolic content in ethanolic extracts of leaves and flowers of some asteraceae species. Recent Pat Food Nutr Agric. 2018; 9(1):42-9. [PMID]
29.Ramadan MF, Kroh LW, Mörsel JT. Radical scavenging activity of black cumin (Nigella sativa L.), coriander (Coriandrum sativum L.), and niger (Guizotia abyssinica Cass.) crude seed oils and oil fractions. J Agric Food Chem. 2003; 51(24):6961-9. [DOI:10.1021/jf0346713][PMID]
30.Shahin YR, Elguindy NM, Abdel Bary A, Balbaa M. The protective mechanism of Nigella sativa against diethylnitrosamine-induced hepatocellular carcinoma through its antioxidant effect and EGFR/ERK1/2 signaling. Environ Toxicol. 2018; 33(8):885-98. [DOI:10.1002/tox.22574]
31.Umar S, Zargan J, Umar K, Ahmad S, Katiyar CK, Khan HA. Modulation of the oxidative stress and inflammatory cytokine response by thymoquinone in the collagen induced arthritis in Wistar rats. Chem Biol Interact. 2012; 197(1):40-6. [DOI:10.1016/j.cbi.2012.03.003]
32.Kang JS, Jeon YJ, Kim HM, Han SH, Yang KH. Inhibition of inducible nitric-oxide synthase expression by silymarin in lipopolysaccharide-stimulated macrophages. J Pharmacol Exp Ther. 2002; 302(1):138-44. [DOI:10.1124/jpet.302.1.138]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
