مقدمه
سرطان کلورکتال یکی از اصلی‌ترین دلایل مرگ‌ومیر در سراسر دنیا محسوب می‌شود و از جمله شایع‌ترین بدخیمی‌های دستگاه گوارش است که عامل اصلی بروز آن به طور دقیق شناخته نشده است. این سرطان چهارمین سرطان شایع در دنیاست [1] و از نظر مرگ‌ومیر پس از سرطان ریه و پستان رتبه سوم را در زنان به خود اختصاص داده. این بیماری در مردان پس از سرطان ریه و پروستات قرار می‌گیرد. با این وجود در مردان سرطان رکتوم و تا حدودی سرطان کلون نزولی و عرضی بیشتر از زنان مشاهده می‌شود [2]. خطر ابتلا به این سرطان از 40 سالگی شروع شده و با افزایش سن، شیوع آن نیز افزایش می‌یابد [3]. در حدود 98 درصد سرطان‌های کلورکتال به صورت آدنوکارسینوم هستند و اغلب در پولیپ‌های آدنوماتوزی ایجاد می‌شوند که با خارج‌سازی درمان‌پذیر هستند [4]. از سوی دیگر، افزایش شیوع سرطان کلورکتال در میان جمعیت ایرانی 40 تا 60 سال پیش‌بینی شده و با وجود بررسی‌های محدود در این زمینه، داده‌ها حاکی از روند رو به گسترش سرطان کلون در جمعیت جوان کشور است که احتمالاً ناشی از تغییر عادات غذایی وگرایش ایرانیان و به خصوص نسل جوان به فست‌فودها و نیز استعمال دخانیات می‌باشد [5].
پروتئین ژن(151648:ID) SGO1 عضو خانواده پروتئین shugoshin است و تصور می‌شود این پروتئین با جلوگیری از فسفوریلاسیون یک زیرواحد کوهسین در هنگام میتوز از سانترومر محافظت می‌کند و تا زمان جدا شدن کروماتیدهای خواهری در مراحل آنافاز میوز و میتوز آن‌ها را در کنار هم نگه می‌دارد. کاهش بیان ژن SGO1 منجر به از بین رفتن زودرس در سانترومر و تفکیک نادرست کروماتیدهای خواهر در حین میتوز می‌شود [8, 7 ,6]. تحقیقات نشان داده است که جهش ژن SGO1 در موش‌های آزمایشگاهی باعث فعال شدن مسیرهایی در سرطان می‌شود که از جمله این مسیرها می‌توان به متابولیسم لیپیدها، سیگنالینگ Notch، سیگنالینگ انسولین و مسیرهای PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptors) اشاره کرد. از سوی دیگر، جهش ژن SGO1 منجر به تغییرات transcriptomic در متابولیسم، تکثیر و پاسخ‌های ایمنی در روده می‌شود که در پیشرفت سرطان نقش دارد. بنابراین می‌توان گفت که رویکردهای درمانی با تمرکز بر مسیرهای شناسایی‌شده ممکن است برای پیشگیری و درمان سرطان روده ارزشمند باشد [9].
آپوپتوز مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول است که عامل‌های متعددی در راه‌اندازی و پیشبرد آبشارهای پیام‌رسانی آن، نقش تعیین‌کننده دارند. مشخص شده است که lncRNAها از طریق تنظیم چرخه سلولی و آپوپتوز نقش مهمی در کنترل رشد سلول ایفا می‌کنند [10]. lncRNAهای ویژه توقف رشد 5 یا GAS5 (Growth arrest-specific) در سلول‌هایی با رشد متوقف‌شده تجمع می‌یابند و سلول‌های پستانداران را به واسطه سرکوب ژن‌های پاسخ‌دهنده به گلوکوکورتیکوئید (glucocorticoids) به آپوپتوز حساس می‌سازد. GAS5 با گیرنده گلوکوکورتیکوئید برهم‌کنش می‌دهد و از فعالیت رونویسی این گیرنده جلوگیری می‌کند [11]. تاکنون روی SGO1 -AS1 (SGO1-antisense 1) تحقیقات زیادی انجام نشده است و در مطالعات محدودی که انجام شده، نتایج نشان داده است که این ‌LncRNA در افراد دارای سرطان سینه و سرطان ریه افزایش دارد [12, 13]. این lncRNA در جوار منطقه ژنی کدکننده SGO1 قرار دارد [14] و با توجه به مطالعاتی که در زمینه نقش SGO1 در روند سرطان صورت گرفته است و نشان داده شده که این ژن هدف خوبی برای القای آپوپتوز است [15]. با توجه به نقش SGO1-AS1 در گلوکوکورتیکوئید و به دنبال آن تومورزایی و تنظیم بیان ژن SGO1، در این مطالعه برای اولین بار میزان بیان ژن‌های SGO1-AS1 و SGO1 به طور هم‌زمان در بافت توموری سرطان کلورکتال در مقایسه با بافت سالم بررسی شد.
مواد و روش‌ها
نوع مطالعه و نمونه‌گیری
تحقیق حاضر در کمیته اخلاق دانشگاه آزاد شهرکرد با کد IR.IAU.SHKREC.1398.020 به تصویب رسیده است. این تحقیق از نوع مورد شاهدی بود که در آن از بافت توموری تازه جراحی‌شده 40 فرد مبتلا به سرطان کلورکتال (از بیمارستان شهرکرد و نمونه تازه جراحی‌شده) و بافت سالم کلون هر شخص، نمونه‌گیری انجام شد. لازم به ذکر است که همه نمونه‌های بافتی توسط پاتولوژیست، بررسی و طبق معیارهای گزارش‌شده، تأیید شد. این نمونه‌های بافت بلافاصله پس از جراحی درون محلول RNA Latter (بهنوژن ساخت کشور ایران) قرار داده شد و به مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل شدند و بلافاصله نمونه‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه و سپس در دمای 20- درجه فریز شدند. در جدول شماره 1 متغیرهای جمعیت‌شناختی و اطلاعات بالینی بیماران آورده شده است.


استخراج RNA، سنتز cDNA و Real time RT-PCR
برای استخراج RNA تام از ترایزول (Invitrogen ساخت کشور امریکا) مطابق پروتکل استفاده شد و سپس RNA استخراج‌شده از لحاظ کیفی و کمی بررسی شد. برای حذف آلودگی احتمالی RNA استخراج‌شده به DNA ژنومی، هر نمونه RNA استخراج‌شده با آنزیم DNaseІ (سیناژن ساخت کشور ایران) به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد تیمار شد و برای خنثی‌سازی آنزیم DNaseI هر نمونه با 1 میکرولیتر اتیلن دی آمین تترا استیک اسید EDTA (مرک ساخت کشور آلمان) تیمار و به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس با استفاده از کیت شرکت یکتا تجهیز آزما و پرایمر 6 نوکلئوتیدی تصادفی، طبق پروتکل کیت، cDNA هر نمونه سنتز شد. برای بررسی میزان بیان ژن‌های مورد نظر، پرایمرهای رفت و برگشت اختصاصی هر ژن با نرم‌افزار BeaconDesigner 8.0 [16] و Oligo7 [17] طراحی شد و پس از BLAST در پایگاه اینترنتی NCBI، توسط شرکت پیشگام سنتز شد. در جدول شماره 2 توالی آغازگرهای استفاده‌شده در روش RT-qPCR آورده شده است.


پس از تأیید صحت سنتز cDNA، از تکنیک Real Time-RT PCR (دستگاه Corbett rotor gene 6000) برای سنجش کمی سطح بیان ژن‌های مورد نظر استفاده شد. برای انجام این تکنیک ازSYBR Green (یکتاتجهیز آزما ساخت کشور ایران) استفاده شد. پس از محاسبه نسبت بیان ژن هدف در نمونه مورد نظر (بیمار) نسبت به نمونه کنترل (سالم) با فرمول محاسبه شد [18].
روش‌های آماری
در این پژوهش پس از به دست آوردن میزان بیان نسبی برای هرکدام از ژن‌های SGO1 و SGO1-AS1 در سرطان کلورکتال و مقایسه نتایج با یکدیگر از آزمون‌های متفاوت استفاده شد. برای آنالیز داده‌ها از نرم‌افزارهای GraphPad Prism و Excel استفاده شد و پس از تأیید نرمال بودن حجم نمونه با آزمون Shapiro برای بررسی اختلاف بیان ژن SGO1 و SGO1-AS1 در بیماران مبتلا به سرطان کلورکتال و سالم از آزمون تی تست استفاده شد. برای مقایسه بیان ژن‌ها در سطوح مختلف از آزمون one way ANOVA استفاده شد. همچنین برای بررسی همبستگی بیان ژن‌های مورد نظر در این پژوهش از آزمون Spearman استفاده شد. برای بررسی اختصاص و حساسیت هریک از ژن‌های موردنظر در این مطالعه نیز آزمون ROC برای ترسیم ROC Curve مورد استفاده قرار گرفت.
یافته‌ها
کاهش بیان SGO1 و افزایش بیان SGO1-AS1 در بافت‌های توموری کلورکتال در مقایسه با بافت‌های نرمال مجاور
همان طور که در تصویر شماره 1 الف مشاهده می‌شود، سطح بیان SGO1 به‌طور معنی‌داری در نمونه‌های توموری در مقایسه با بافت سالم چهار برابر کاهش نشان داد (0/001>P)؛ در حالی که سطح بیان SGO1-AS1 در بافت توموری در مقایسه با بافت نرمال به میزان 1/7 برابر افزایش معنی‌داری نشان داد (تصویر شماره 1ب ) (0/0116=P)

سپس برای بررسی همبستگی بیان ژن SGO1 و SGO1-AS1 توزیع داده‌ها با استفاده از آزمون شاپیرو ویلک بررسی شد و با مشاهده (0/05>P) مشخص شد که توزیع داده‌ها نرمال نیست، بنابراین از آزمون Spearman همبستگی این دو ژن ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که این دو ژن در بافت توموری، همبستگی منفی دارند (0/03588-)، اما این همبستگی بیانی معنی‌دار نیست.
افزایش سطح رونوشت SGO1 و کاهش SGO1-AS1 در گروه زیر 60 سال در مقایسه با گروه بالای 60 سال
در این مطالعه، سطح بیان SGO1 و SGO1-AS1 در دو گروه بیشتر از 60 سال و کمتر از 60 سال در بافت‌های توموری نشان داد که سطح بیان این ژن‌ها در دو گروه بررسی‌شده تغییر معنی‌داری دارد. سطح بیان SGO1 در گروه کمتر از 60 سال بیان کمتری نشان می‌دهد، در حالی که سطح بیان SGO1-AS1 در این گروه سنی در مقایسه با گروه بیشتر از 60 سال افزایش معنی‌داری نشان می‌دهد. در تصویر شماره 2 الف و ب، تصویر شماره 1 تغییر سطح بیان نسبی ژن‌ها در سطح Ct Δ -2 در دو گروه سنی در بافت‌های توموری نشان داده شده است. 
 

 

Refrences
1.Geboes K, Ectors N, Geboes KP. Pathology of early lower GI cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2005; 19(6):963-78. DOI:10.1016/j.bpg.2005.04.005][PMID]
2.Ansari R, Mahdavinia M, Sadjadi A, Nouraie M, Kamangar F, Bishehsari F, et al. Incidence and age distribution of colorectal cancer in Iran: esults of a population-based cancer registry. Cancer Lett. 2006; 240(1):143-7. [DOI:10.1016/j.canlet.2005.09.004][PMID]
3.Burt RW, Barthel JS, Dunn KB, David DS, Drelichman E, Ford JM, et al. Colorectal cancer screening. J Natl Compr Canc Ne. 2010; 8(1):8-61. [DOI:10.6004/jnccn.2010.0003]
4.Kumar V, Abbas AK, Aster JC. Robbins basic pathology e-book. Amsterdam: Elsevier Health Sciences; 2017. https://books.google.com/books?id=YYZMDgAAQBAJ&dq
5.Pahlavan PS, Kanthan R. The epidemiology and clinical findings of colorectal cancer in Iran. J Gastrointestin Liver Dis. 2006; 15(1):15-9. [PMID]
6.Mahapatra K, Roy S. An insight into the folding and stability of Arabidopsis thaliana SOG1 transcription factor under salinity stress in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2019; 515(4):531-7. [DOI:10.1016/j.bbrc.2019.05.183] [PMID]
7.Piché J, Gosset N, Legault LM, Pacis A, Oneglia A, Caron M, et al. Molecular signature of CAID syndrome: Noncanonical roles of SGO1 in regulation of TGF-β signaling and epigenomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019; 7(2):411-31. [DOI:10.1016/j.jcmgh.2018.10.011] [PMID]
8.Mishra PK, Thapa KS, Chen P, Wang S, Hazbun TR, Basrai MA. Budding yeast CENP-ACse4 interacts with the N-terminus of SGO1 and regulates its association with centromeric chromatin. Cell Cycle. 2018; 17(1):11-23. [DOI:10.1080/15384101.2017.1380129] [PMID]
9.Rao CV, Sanghera S, Zhang Y, Biddick L, Reddy A, Lightfoot S, et al. Systemic chromosome instability resulted in colonic transcriptomic changes in metabolic, proliferation, and stem cell regulators in SGO1−/+ Mice. Cancer Res. 2016; 76(3):630-42. [DOI:10.1158/0008-5472.CAN-15-0940]
10.Ulitsky I, Bartel DP. lincRNAs: Genomics, evolution, and mechanisms. Cell. 2013; 154(1):26-46. [DOI:10.1016/j.cell.2013.06.020] [PMID]
11.Kugel JF, Goodrich JA. Non-coding RNAs: Key regulators of mammalian transcription. Trends Biochem Sci. 2012; 37(4):144-51. [DOI:10.1016/j.tibs.2011.12.003] [PMID] [PMCID]
12.Yao Y, Dai W. Shugoshins function as a guardian for chromosomal stability in nuclear division. Cell Cycle. 11(14):2631-42. [DOI:10.4161/cc.20633] [PMID] [PMCID]
13.Gooding AJ, Zhang B, Jahanbani FK, Gilmore HL, Chang JC, Valadkhan S, et al. The lncRNA BORG drives breast cancer metastasis and disease recurrence. Sci Rep. 2017; 7(1):1-18. [DOI:10.1038/s41598-017-12716-6]
14.Nasim N, Ghafouri-Fard S, Soleimani S, Esfandi F, Shirkhoda M, Safaei M, et al. Assessment of SGO1 and SGO1-AS1 contribution in breast cancer. Hum Antibodies. 2019; 27(4):279-84.[DOI:10.3233/HAB-190384] [PMID]
15.Yang Y, Wang X, Dai W. Human SGO1 is an excellent target for induction of apoptosis of transformed cells. Cell Cycle. 2006; 5(8):896-901. [DOI:10.4161/cc.5.8.2691] [PMID]
16.Thornton B, Basu C. Rapid and simple method of qPCR primer design. In: Basu C, editor. PCR Primer Design. Berlin; Springer; 2015. p. 173-9. [DOI:10.1007/978-1-4939-2365-6_13]
17.Rychlik W. OLIGO 7 primer analysis software. In: Yuryev A, editor. PCR Primer Design. Berlin: Springer; 2007. p. 35-59. [DOI:10.1007/978-1-59745-528-2_2]
18.Chen C, Tan R, Wong L, Fekete R, Halsey J. Quantitation of microRNAs by real-time RT-qPCR. In: Park DJ, PCR Protocols. Berlin: Springer; 2011. pp. 113-34. [DOI:10.1007/978-1-60761-944-4_8]
19.Wang LH, Yen CJ, Li TN, Elowe S, Wang WC, Wang LHC. SGO1 is a potential therapeutic target for hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 2015; 6(4):2023-33. [DOI:10.18632/oncotarget.2764][PMID][PMCID]
20.Ong MS, Cai W, Tan TZ, Huang RY-J, Hooi SC, Yap CT, et al. Long non-coding RNA landscape in colorectal cancer. RNA Dis. 2019; 6(2019):1-9. [DOI:10.14800/rd.1628]
21.Mu J, Fan L, Liu D, Zhu D. Overexpression of shugoshin1 predicts a poor prognosis for prostate cancer and promotes metastasis by affecting epithelial-mesenchymal transition. Onco Targets Ther. 2019; 12:1111-8. [DOI:10.2147/OTT.S191157] [PMID][PMCID]