دوره 24، شماره 4 - ( مهر و آبان 1400 )
جلد 24 شماره 4 صفحات 615-596 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Pirmoradi S, Jafari H. Design of Immunosuppressive Structure Based on Spike Protein (s) virus Corona. J Arak Uni Med Sci 2021; 24 (4) :596-615
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6494-fa.html
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-6494-fa.html
پیرمرادی سعید، جعفری هدیه. طراحی سازه ایمنی‌زا بر اساس پروتئین اسپایک (s) ویروس کرونا. مجله دانشگاه علوم پزشكي اراك. 1400; 24 (4) :596-615
سعید پیرمرادی1 
، هدیه جعفری 2
، هدیه جعفری 2
1- گروه بیوشیمی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.
2- مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات و آموزش و ترویج کشاورزی، اهواز، ایران. ، pirmoradi150@gmail.com
2- مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم‌سازی رازی، سازمان تحقیقات و آموزش و ترویج کشاورزی، اهواز، ایران. ، pirmoradi150@gmail.com
متن کامل [PDF 9058 kb]
(579 دریافت)
| چکیده (HTML) (1920 مشاهده)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
متن کامل: (1083 مشاهده)
مقدمه
کرونا ویروس انسانی متعلق به خانواده کروناویریده (آلفاکروناویروس) است [1] و گروه بزرگی از ویروس‌های دارای آراِن‌اِی تک‌رشته پوشش‌دار مثبت را شامل می‌شود. این ویروس دارای بزرگ‌ترین ژنوم شناختهشده آراِن‌اِی ویروس‌ها است. معمولاً کرونا ویروس‌ها، بر اساس واکنش متقابل سرولوژیکی به سه گروه (گروه I تا III) طبقه‌بندی می‌شوند. این نوع طبقه‌بندی در آنها توسط تجزیه‌و‌تحلیل تکاملی پشتیبانی می‌شود.
ویروس‌های گروه I از عوامل بیماری‌زای حیوانات، ازجمله ویروس اسهال اپیدمی خوک و ویروس پریتونیت عفونی گربه هستند. ویروس‌های گروه II مسئول عفونت‌های بیماری‌زا در حیوانات خانگی هستند و ویروس‌های گروه آخر (III) مسئول عفونت پرندگان هستند [2].
مولکول‌های پروتئینی که معمولاً در ساختار همه ویروس‌ها نقش دارند، سنبله، پوششی ، غشای و نوکلئوکپسید هستند. کروناویروس انسانی یاHCoV معمولاً یکی از مهم‌ترین عوامل ایجاد‌کننده عفونت‌های دستگاه تنفسی فوقانی و همچنین عامل ایجاد‌کننده «ذات الریه پنومونی» هستند که برای اولین بار در جمهوری خلق چین مشخص شد.
امروزه به خاطر مشکلات زیستی زیاد ناشی از آنها لازم است [3] یک پیشگیری مؤثر برای کوروناویروس انسانی ایجاد شود.این در حالی است که در حال حاضر، هیچ درمانی یا واکسنی در دسترس برای درمان عفونت ناشی از کوروناویروس انسانی وجود ندارد. با توجه به گسترش روزافزون عفونت ناشی از این ویروس، ایجاد واکسن یا داروهای ضدویروسی علیه عفونت‌های HCoVs بسیار مهم است.
در سال‌های اخیر یک سری رویکرد جدید با استفاده از فرایندهای مبتنی بر ایمونوژنتیک، ایمونوژنومیک و بیوانفورماتیک یا برای توسعه واکسن‌ها به‌عنوان واکسینومیکس شناخته شده‌اند که از این روش برای تولید واکسن‌های جدید استفاده‌های زیادی شده و در حال انجام است. رویکرد مرسوم در حال حاضر برای توسعه واکسن بر بیان آنتی‌ژن در مقدار کافی و از مدل‌های کشت آزمایشگاهی متکی است.
با این حال، بسیاری از آنتی‌ژن‌ها، اگرچه به میزان کافی بیان شده‌اند، اما شایدکاندیداهای خوبی برای واکسن نباشند. با استفاده از رویکردهای متعارف گذشته، کنترل انواع مختلف شیوع پاتوژن‌های ویروسی مانند سویه‌های آنفلوآنزای مرغی و پرندگان اخیر به دلیل روند توسعه زمان بر آنها، ممکن نیست. از این رو، با استفاده از پیشرفت سریع در توالی‌یابی بسیاری از ژنوم‌های پاتوژن و پایگاه داده‌های توالی پروتئین، رویکرد سریع و انعطاف‌پذیر اینسیلیکو محبوبیت زیادی کسب کرد. رویکرد «واکسینومیک» در حال حاضر ثابت شده که برای مبارزه با بیماری‌هایی از قبیل ام اس یا مولتیپل اسکلروزیس، مالاریا و تومورها ضروری است [4 ,5, 6].
با این حال، روش‌های توسعه واکسن معمولاً از طریق شناسایی لیگاند‌های آنتی‌ژن‌های لکوسیت انسانی انجام می‌شود [7]. ارزیابی آلرژی‌زایی یکی از مراحل اساسی در ساخت واکسن‌های پپتیدی است، زیرا وقتی واکسن را وارد بدن انسان می‌کنیم، به‌عنوان یک ماده خارجی تشخیص داده می‌شود. درنتیجه، التهاب رخ می‌دهد و یک واکنش آلرژیک ایجاد می‌کند. برای پیش‌بینی اپی‌توپ سلول B، آب‌گریزی یک معیار مهم است که معمولاً در ناحیه پیچ بتا است. این ارزیابی‌ها، احتمال ایجاد کاندیداهای مطلوب واکسن را تقویت می‌کند.
بنابراین در مطالعه حاضر با استفاده از رویکرد واکسینومیک، یک واکسن پپتیدی مبتنی بر اپی‌توپ علیه پروتئین اسپایک کرونا ویروس انسانی طراحی شد که از محققان در آزمایشگاه‌های مربوطه خود انتظار می‌رود که با آزمایشات مطلوب پیش‌بینی ما در مورد واکسن طراحی‌شده را بتوانند تأیید کنند.
موادها و روش‌ها
انتخاب توالی پروتئین اسپایک کرونا ویروس
پایگاه داده ویرال زون، پایگاه داده‌ای بیوانفورماتیکی اکس‌پاسی و پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی منابع مهم برای انتخاب توالی پروتئین‌های HCoVs و اطلاعات مرتبط با آنها ازجمله جنس، خانواده، میزبان، انتقال، بیماری، ژنوم و پروتئوم هستند.
بازیابی توالی پروتئین
پروتئین غشای بیرونی (پروتئین سنبله) اسپایک، توالی HCoV از پایگاه داده‌های مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی بازیابی شد. سپس تمام توالی در فرمت FASTA برای تحلیل و بررسی بیشتر ذخیره شدند و باید از لحاظ سینگال پپتید نیز توسط SignalP بررسی شوند و اگر سیگنال پپتید داشت، حذف شود. ما برای انجام فرایند طراحی واکسن بر مبنای اپی‌توپ‌های پپتیدی از روش پیش‌بینی اپیتوپها استفاده کردیم. در این روش از دیتابیس IEDB استفاده کردیم. در این دیتابیس با تعیین عناصر مربوطه و انتخاب پروتئین مورد نظر و سابمیت کردن آن در این سرور، به تعداد زیادی از اپی‌توپ‌های بر مبنای سلول B و MHCI ،MHCII دسترسی پیدا می‌کنیم. سپس از بین این اپی‌توپ‌های ارائه‌شده تک تک به بررسی اپی‌توپ‌های مورد نظر پرداخته و از بین آنها تعدادی را به‌عنوان نمونه برای ایجاد سازه ایمنی‌زا انتخاب شد.
بررسی آنتی‌ژنسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
در ادامه غربالگری از سرور VaxiJenv2.0 برای پیش‌بینی آنتی‌ژنسیته زیر واحدهای اپی‌توپی واکسن برای تعیین قوی‌ترین پروتئین‌های آنتی‌ژنی استفاده شد. در اینجا، ما از پارامترهای پیش فرض این سرور برای تعیین پروتئین آنتی‌ژن استفاده کردیم [8].
تعیین الرژنسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
از سرور مبتنی بر وب AllerTOP برای پیش‌بینی حساسیت اپی‌توپ پیشنهادی ما برای تولید سازه ایمنی‌زا استفاده شد. این سرور حساسیت‌های آلرژیکی را از طریق پیش‌بینی ترکیبی ارزیابی کرده و AllerTOP حساسیت‌ها و nonallergens را با ویژگی بالایی پیش‌بینی می‌کند. این امر باعث می‌شود که AllerTOP برنامه بسیار مفیدی برای پیش‌بینی واکنش متقابل آلرژن است [9].
بررسی توکسیسیتی اپی‌توپ‌های انتخابی
در مرحله بعدی باید اپی‌توپ‌های مورد مطالعه را از نظر میزان سمیت نیز بررسی کنیم که برای این کار از نرم‌افزار Toxinpred استفاده شد و اپی‌توپ‌های مربوط به T ،B را که مشکل سمیت نداشتن را انتخاب می‌کنیم.
پیکربندی ترکیب کایمر اولیه از واکسن اپی‌توپی طراحی‌شده
پس از چندین مرحله غربالگری اپیتوپها، حال باید پروتئین کایمر را که به‌عنوان سازه ایمنی‌زا (واکسن احتمالی) از اپی‌توپ‌هایی که غربالگری کردیم، ایجاد کنیم. برای انجام این کار اپی‌توپ‌های B ،T را کنار هم قرار گرفتند و توسط ترکیبات لینکر مانند KK به هم وصل شدند که در اتصالات اپیتوپها از لینکرهای منعطف استفاده می‌شود و پس از تکمیل ایجاد توالی کایمر اولیه به دو سر توالی کایمر ایجاد شده از اپی‌توپ‌های انتخاب‌شده، یک ترکیب ادجوانت مانند CTxB با کمک لینکرهای سخت مانند PAPAP اضافه شد تا ساختار سازه ایمنی‌زای اولیه ما تکمیل شود. از دیتابیس PDB برای تهیه توالی ادجوانت مورد نظر استفاده شد.
ارزیابی واکسن کایمر از نظر ساختاری و قابلیت اتصال به سلول‌های B و ترکیباتMHCI وII پس از ایجاد سازه ایمنی‌زای کایمری آن را قبل از ورود به فاز آزمایشگاهی باید از ابعاد مختلف دیگر مورد بررسی قرار داد که در ادامه به آنها می‌پردازیم.
بررسی ساختار دوبُعدی پروتئین واکسن کایمر
در مرحله اول باید سازه ایمنی‌زای کایمری خود را از لحاظ داشتن آلفا هلیکس و صفحات بتا و پیچ‌های تصادفی در ساختار دوم پروتئینی بررسی کنیم، زیرا وجود آلفا هلیکس بالای سه عدد فرایند بیان را برای کسانی که قصد کلون کردن دارند را دچار مشکل می‌کند. به همین دلیل برای بررسی این حالات باید به بررسی ساختار دوم پروتئین از طریق سرور PRABI و از طریق روش GORIV استفاده شد.
بررسی ساختار سه‌بُعدی واکسن مدل
در مرحله بعد باید ساختار سه‌بُعدی سازه ایمنی‌زای کایمری را بررسی کنیم، زیرا یک واکسن پپتیدی اگر بخواهد کارایی خوبی داشته باشد، باید ساختار سه‌بُعدی پایداری داشته باشد. به همین دلیل برای بررسی این ساختار از روش همولوژی مدلینگ و از سرور SWISSMODEL استفاده می‌کنیم و با بررسی sequence identity و local quality Estimate و QMEAN4 و ZSCORE بهترین مدل را برای محاسبات بعدی انتخاب می‌کنیم، اما اگر مدل انتخابی ما طی بررسی‌ها نیاز به refine کردن داشت از سرور دیگری به نام 3Drefine فرایند refine کردن را روی آن انجام می‌دهیم تا مدل‌های refine شده‌ای به دست آوریم که این مدل‌ها نسبت به قبلی ساختارش به ساختار طبیعی نزدیک‌تر است.
بررسی جایگاه امینواسیدها و پیوندها در مدل واکسن
حال پس از آنکه مدل مطلوب از سازه ایمنی‌زای کایمری به دست آمد، آن را باید از نظر باندها و جایگاه مطلوب امینواسیدها که از لحاظ فضایی در کجای پروتئین مورد بررسی ما قرار گرفته‌اند با استفاده از سرور PROCHECK و توسط تحلیل نمودار راماچانداران مورد بررسی قرار داده شد.
بررسی فیزیک و شیمیایی واکسن مدل
در این مرحله مدل پروتئینی سازه ایمنی‌زای کایمری به‌دست‌آمده باید از نظر خصوصیات فیزیک و شیمیایی مانند درصد و بار اسید امینه‌ها و وزن مولکولی و قطبیت و ضریب خاموشی و نیمه عمر و شاخص ناپایداری و حلالیت در آب و شاخص الیفاتیک نیز بررسی شوند. به همین دلیل برای این نوع از بررسی‌ها از سرورهای مختلفی مانند PEPCALC و protParam استفاده شد.
بررسی پایداری واکسن مدل
در ادامه ارزیابی‌های سازه ایمنی‌زای مدل‌شده اگر پروتئین مورد بررسی ما ناپایدار بود با کمک سرور دیگری به نام IUPRED2A آن را بررسی می‌کنیم که بخش‌های ناپایدار و disorder را در ساختار آن مشخص کنیم تا اگر خواستیم آن را اصلاح کنیم، بتوانیم راحت‌تر و با انتخاب امینواسیدها در موقعیت‌های نامنظم ساختار مدل سازه ایمنی‌زای اصلاحات لازم را انجام دهیم.
قابلیت اتصال به مجتمع اصلی سازگاری بافتی یا MHC
آخرین مرحله بررسی واکسن مورد نظرمان این است که بررسی کنیم که آیا واکسن طراحی شده ما قابلیت اتصال به MHCI و MHCII شناسایی توسط ایمنوگلوبین‌ها و سلول‌های B را دارد یا خیر.
پیش‌بینی اپی‌توپ سلول T
اپی‌توپ‌های پپتیدی نقش مهمی در تعیین واکسن دارند. مهم‌تر از همه این است که تشخیص آنها به شیوه Insilico هزینه و زمان را در مقایسه با روش‌های آزمایشگاهی مربوطه کاهش می‌دهد. با استفاده از ابزارهای قابل دسترسی برخط مانند IEDB ،Propred-1 و ابزار MCH2PRED، اپی‌توپ‌های CTL پروتئین هدف MHC کلاس I و MHC کلاس II را به ترتیب پیش‌بینی کرد. نتایج این ابزارها بسیار مهم است؛ زیرا از تعداد زیادی آلل HLA (آنتی‌ژن‌های انسانی-لکوسیتی) در طول محاسبه استفاده می‌کنند. توالی‌ها در قالبی ساده ارائه و همه آلل‌ها برای پیش‌بینی انتخاب شدند.
شناسایی اپی‌توپ سلول B
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های بالقوه ایمنی در یک توالی پروتئین داده شده شاید به طور قابل توجهی تلاش آزمایشگاهی مرطوب مورد نیاز برای کشف اپی‌توپ‌های مورد نیاز برای طراحی واکسن‌ها و برای تشخیص ایمنی را کاهش دهد. هدف از پیش بینی اپی‌توپ سلول B یافتن آنتی‌ژن بالقوه‌ای است که می‌تواند با لنفوسیت‌های B تعامل داشته و یک پاسخ ایمنی مطلوب را آغاز کند. سپس اپی‌توپ‌های سلول B توسط IEDB به‌صورت برخط و بر اساس برخی روش‌های مبتنی بر سرور IEDB برای شناسایی آنتی‌ژن سلول B، شامل مقیاس آنتی‌ژن Kolaskar و Tongaonkar پیش‌بینی دسترسی به سطح Emini، پیش‌بینی انعطاف‌پذیری Karplus و Schulz و تجزیه و تحلیل پیش‌بینی اپی‌توپ خطی Bepipred و ابزار پیش‌بینی Chou و Fasman برای پیش‌بینی پیچ بتا استفاده شد [10, 11, 12 ,13 ,14].
در این مطالعه از پروتئین سنبله یا اسپایک کرونا ویروس که از مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی به دست آمد، برای طراحی استفاده شد و توالی امینو اسیدی قطعات انتخاب‌شده اپیتوپها، توسط سرور VAXIJEN و سرورهای AllerTOP و toxinpred بررسی شدند.
داکینگ مولکولی
برای بررسی این برهم‌کنش‌ها از روش داکینگ مولکولی توسط نرم‌افزارهای خاص مثل Cluspro استفاده شد تا از این روش بتوانیم جهت‌گیری صحیح دو مولکول مختلف (واکسن با MHCI و MHCII) را برای تشکیل یک کمپلکس پایدار را به دست آوریم. به همین دلیل برای این کار ساختارهای PDB مدل سازه ایمنی‌زای تولید‌شده را مورد بررسی و MHCهای شاخص برای کلاس I ،II را از دیتابیس RCSC تهیه کنیم و از طریق نرم‌افزارهایی مثل CONTEXT هترو اتم‌های MCHI و MHCII را حذف می‌کنیم.
آلل‌های فرکانس شاخص در جمعیت سفید پوست به نام‌های HLA-A0201 برای کلاس MHCI و HLA-DRB1-0101 برای کلاس MHCII را انتخاب کرده و توالی آنها نیز از RCSB تهیه شد و سپس هر‌کدام را جداگانه برای فرایند داکینگ وارد نرم‌افزار Cluspro برای بررسی اتصال با واکسن طراحی‌شده کردیم و آنها را از لحاظ سطح انرژی اتصالی بررسی کردیم و بهترین حالت‌های برهمکنش را در آنها به دست آوردیم. واکسن‌های مبتنی بر پپتیدها متنوع ساختاری میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا، امروزه یکی از گزینه‌های امیدوار‌کننده برای طراحی واکسن‌ها به شمار می‌آید.
یافته‌ها
تعیین اپی‌توپ‌های مورد نیاز برای تولید واکسن کایمر
در این مطالعه تعدادی توالی پپتیدی در اندازه‌های مختلف از پایگاه داده IEDB به‌عنوان کاندی‌های تولید پروتئین واکسن کایمری تهیه شد. سپس با کمک یک سری لینکر انعطاف‌پذیر به نام لینکرهای لیزین/لیزین (KK) توالی‌های اپی‌توپی به هم متصل شدند و در انتهای C و انتهای N توالی‌های پپتدی توسط لینکر سخت PAPAP توالی ادجوانت cholera B-subunit (CTxB) را که از پایگاه داده Uniport دریافت شده بودند، اضافه شد تا ساختار اولیه پروتئینی سازه ایمنی‌زای کایمر ایجاد شود. در این مرحله انتخاب توالی‌های پپتیدی و چیدمان آنها بسیار مهم است که سعی شد پپتیدهای مربوط به سلول‌های B ،T را هر کدام کنار هم قرارداده شود و به همدیگر متصل شوند.
نتایج بررسی آنتی‌ژنسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
در مرحله اول پس از آنکه با استفاده سرور IEDB آنتی‌ژن‌های مورد نظر را از بررسی توالی امینواسیدی پروتئین اسپایک کرونا ویروس به دست آورده شد. تک تک این اپی‌توپ‌های پپتیدی را از طریق نرم‌افزار VAXIJEN برای تعیین خاصیت آنتی‌ژنسیته مورد بررسی قرار گرفتند و از بین آنها هشت عدد که دارای ویژگی آنتی‌ژنسیته مطلوب‌تری بودند، انتخاب شدند که در بین آنها کمترین و بیشترین امتیاز 0.4710 و 0.9116 را از سرور VAXIJEN به خود اختصاص دادند. نمرات به‌دست‌آمده حاکی از ماهیت آنتی‌ژنتیکی توالی پروتئین سازه ایمنی‌زا ایجاد شده است. به همین دلیل از این توالی‌ها برای طراحی سازه ایمنی‌زای مولتی اپی‌توپ استفاده شده است [8].
نتایج بررسی آلرژیسیته اپی توپهای انتخابی
پس از بررسی ویژگی آنتی‌ژنسیته اپی‌توپ‌های منتخب حال نوبت به بررسی خاصیت الرژنسیته آنها است. به‌طور کلی سازه ایمنی‌زای آلرژیک می‌تواند باعث ایجاد واکنش‌های ایمنی واکنشی متقاطع خاص آلرژن در بدن میزبان مانند بثورات پوستی و تورم غشاهای مخاطی شود. به همین دلیل در این مرحله تمام آنها جداگانه و تک تک با کمک نرم‌افزار ALLerTPv.2.0 ارزیابی شدند و مواردی از اپیتوپها که ریسک آلرژیایی داشتند، حذف شدند و آن‌هایی را که فاقد ویژگی آلرژیایی بودند، برای سنتز سازه ایمنی‌زا جدا شدند تا بررسی‌های بعدی در مورد آنها انجام شود [15, 16].
نتایج بررسی توکسیسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
در این مرحله و در ادامه ارزیابی‌های سازه ایمنی‌زا باید تک تک اپی‌توپ‌های پیشنهادی که در دو مرحله قبل از لحاظ آنتی‌ژنسیته و آلرژیایی بررسی شدن را از لحاظ سمیت و توکسسیتی و با کمک نرم‌افزار Toxinpred مورد ارزیابی قرار گیرند و پس از آنکه اپی‌توپ‌های مورد نظر از لحاظ توکسیسیته بی‌خطر بودند، به جداسازی هشت عدد از آنها برای تولیدسازه ایمنی‌زای کایمر که به‌عنوان ترکیب اولیه واکسن محسوب می‌شود، پرداخته شود [17].
نتایج پیکربندی و طراحی ساختار اولیه پروتئین کایمر واکسن
در این مرحله از طراحی سازه ایمنی‌زا باید اپی‌توپ‌های پپتیدی که در مراحل قبلی آنالیز جداسازی شدند به همدیگر متصل شوند تا توالی ساختار اولیه سازه ایمنی‌زای کایمر شکل بگیرد. به همین دلیل در این مرحله ابتدا اپیتوپها باید کنار هم قرار داده شوند و بین آنها از لینکرهای لیزین/لیزین برای اتصال استفاده شود. سپس از طریق پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی توالی ادجوانت (cholera toxinB subunite) مورد نیاز را به دست آورده و با کمک لینکر سخت PAPAPبه انتهای N و انتهای C توالی سازه ایمنی‌زای کایمر متصل شد (البته در به دست آوردن توالی ادجوانت باید دقت شود که از نمونه‌های partial نباشد) که با این کار ساختار اولیه توالی‌های سازه ایمنی‌زای کایمر جهت بررسی‌های بعدی ایجاد شد.
نتایج ارزیابی ساختار دوبُعدی و سه‌ُبعدی سازه ایمنی‌زا
در ادامه ارزیابی ترکیب سازه ایمنی‌زای تولید‌شده، از نظر ساختار دوبُعدی و سه‌بُعدی بررسی شد که اگر در ساختار ان تاخوردگی‌های نامطلوب ایجاد شود در همین ابتدای کار آن بخش‌های اپی‌توپی برهم‌زننده ساختار سازه ایمنی‌زا را از ساختار اولیه آن حذف کرد. به همین دلیل ابتدا با کمک نرم‌افزار prabi و با استفاده از روش GORIV ساختار دوم سازه ایمنی‌زا بررسی شد و نتایج حاصل از این بررسی این‌گونه بود که ساختار دوم ترکیب سازه ایمنی‌زا از نظر درصد آلفا هلیکس 43.21 درصد بود. درصد بالای آلفا هلیکس بعداً در فرایندهای کلونینگ اگر شخصی محقق بخواهد کارهای کلونینگ کند، مشکل‌ساز می‌شود (تصویر شماره 1).
کرونا ویروس انسانی متعلق به خانواده کروناویریده (آلفاکروناویروس) است [1] و گروه بزرگی از ویروس‌های دارای آراِن‌اِی تک‌رشته پوشش‌دار مثبت را شامل می‌شود. این ویروس دارای بزرگ‌ترین ژنوم شناختهشده آراِن‌اِی ویروس‌ها است. معمولاً کرونا ویروس‌ها، بر اساس واکنش متقابل سرولوژیکی به سه گروه (گروه I تا III) طبقه‌بندی می‌شوند. این نوع طبقه‌بندی در آنها توسط تجزیه‌و‌تحلیل تکاملی پشتیبانی می‌شود.
ویروس‌های گروه I از عوامل بیماری‌زای حیوانات، ازجمله ویروس اسهال اپیدمی خوک و ویروس پریتونیت عفونی گربه هستند. ویروس‌های گروه II مسئول عفونت‌های بیماری‌زا در حیوانات خانگی هستند و ویروس‌های گروه آخر (III) مسئول عفونت پرندگان هستند [2].
مولکول‌های پروتئینی که معمولاً در ساختار همه ویروس‌ها نقش دارند، سنبله، پوششی ، غشای و نوکلئوکپسید هستند. کروناویروس انسانی یاHCoV معمولاً یکی از مهم‌ترین عوامل ایجاد‌کننده عفونت‌های دستگاه تنفسی فوقانی و همچنین عامل ایجاد‌کننده «ذات الریه پنومونی» هستند که برای اولین بار در جمهوری خلق چین مشخص شد.
امروزه به خاطر مشکلات زیستی زیاد ناشی از آنها لازم است [3] یک پیشگیری مؤثر برای کوروناویروس انسانی ایجاد شود.این در حالی است که در حال حاضر، هیچ درمانی یا واکسنی در دسترس برای درمان عفونت ناشی از کوروناویروس انسانی وجود ندارد. با توجه به گسترش روزافزون عفونت ناشی از این ویروس، ایجاد واکسن یا داروهای ضدویروسی علیه عفونت‌های HCoVs بسیار مهم است.
در سال‌های اخیر یک سری رویکرد جدید با استفاده از فرایندهای مبتنی بر ایمونوژنتیک، ایمونوژنومیک و بیوانفورماتیک یا برای توسعه واکسن‌ها به‌عنوان واکسینومیکس شناخته شده‌اند که از این روش برای تولید واکسن‌های جدید استفاده‌های زیادی شده و در حال انجام است. رویکرد مرسوم در حال حاضر برای توسعه واکسن بر بیان آنتی‌ژن در مقدار کافی و از مدل‌های کشت آزمایشگاهی متکی است.
با این حال، بسیاری از آنتی‌ژن‌ها، اگرچه به میزان کافی بیان شده‌اند، اما شایدکاندیداهای خوبی برای واکسن نباشند. با استفاده از رویکردهای متعارف گذشته، کنترل انواع مختلف شیوع پاتوژن‌های ویروسی مانند سویه‌های آنفلوآنزای مرغی و پرندگان اخیر به دلیل روند توسعه زمان بر آنها، ممکن نیست. از این رو، با استفاده از پیشرفت سریع در توالی‌یابی بسیاری از ژنوم‌های پاتوژن و پایگاه داده‌های توالی پروتئین، رویکرد سریع و انعطاف‌پذیر اینسیلیکو محبوبیت زیادی کسب کرد. رویکرد «واکسینومیک» در حال حاضر ثابت شده که برای مبارزه با بیماری‌هایی از قبیل ام اس یا مولتیپل اسکلروزیس، مالاریا و تومورها ضروری است [4 ,5, 6].
با این حال، روش‌های توسعه واکسن معمولاً از طریق شناسایی لیگاند‌های آنتی‌ژن‌های لکوسیت انسانی انجام می‌شود [7]. ارزیابی آلرژی‌زایی یکی از مراحل اساسی در ساخت واکسن‌های پپتیدی است، زیرا وقتی واکسن را وارد بدن انسان می‌کنیم، به‌عنوان یک ماده خارجی تشخیص داده می‌شود. درنتیجه، التهاب رخ می‌دهد و یک واکنش آلرژیک ایجاد می‌کند. برای پیش‌بینی اپی‌توپ سلول B، آب‌گریزی یک معیار مهم است که معمولاً در ناحیه پیچ بتا است. این ارزیابی‌ها، احتمال ایجاد کاندیداهای مطلوب واکسن را تقویت می‌کند.
بنابراین در مطالعه حاضر با استفاده از رویکرد واکسینومیک، یک واکسن پپتیدی مبتنی بر اپی‌توپ علیه پروتئین اسپایک کرونا ویروس انسانی طراحی شد که از محققان در آزمایشگاه‌های مربوطه خود انتظار می‌رود که با آزمایشات مطلوب پیش‌بینی ما در مورد واکسن طراحی‌شده را بتوانند تأیید کنند.
موادها و روش‌ها
انتخاب توالی پروتئین اسپایک کرونا ویروس
پایگاه داده ویرال زون، پایگاه داده‌ای بیوانفورماتیکی اکس‌پاسی و پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی منابع مهم برای انتخاب توالی پروتئین‌های HCoVs و اطلاعات مرتبط با آنها ازجمله جنس، خانواده، میزبان، انتقال، بیماری، ژنوم و پروتئوم هستند.
بازیابی توالی پروتئین
پروتئین غشای بیرونی (پروتئین سنبله) اسپایک، توالی HCoV از پایگاه داده‌های مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی بازیابی شد. سپس تمام توالی در فرمت FASTA برای تحلیل و بررسی بیشتر ذخیره شدند و باید از لحاظ سینگال پپتید نیز توسط SignalP بررسی شوند و اگر سیگنال پپتید داشت، حذف شود. ما برای انجام فرایند طراحی واکسن بر مبنای اپی‌توپ‌های پپتیدی از روش پیش‌بینی اپیتوپها استفاده کردیم. در این روش از دیتابیس IEDB استفاده کردیم. در این دیتابیس با تعیین عناصر مربوطه و انتخاب پروتئین مورد نظر و سابمیت کردن آن در این سرور، به تعداد زیادی از اپی‌توپ‌های بر مبنای سلول B و MHCI ،MHCII دسترسی پیدا می‌کنیم. سپس از بین این اپی‌توپ‌های ارائه‌شده تک تک به بررسی اپی‌توپ‌های مورد نظر پرداخته و از بین آنها تعدادی را به‌عنوان نمونه برای ایجاد سازه ایمنی‌زا انتخاب شد.
بررسی آنتی‌ژنسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
در ادامه غربالگری از سرور VaxiJenv2.0 برای پیش‌بینی آنتی‌ژنسیته زیر واحدهای اپی‌توپی واکسن برای تعیین قوی‌ترین پروتئین‌های آنتی‌ژنی استفاده شد. در اینجا، ما از پارامترهای پیش فرض این سرور برای تعیین پروتئین آنتی‌ژن استفاده کردیم [8].
تعیین الرژنسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
از سرور مبتنی بر وب AllerTOP برای پیش‌بینی حساسیت اپی‌توپ پیشنهادی ما برای تولید سازه ایمنی‌زا استفاده شد. این سرور حساسیت‌های آلرژیکی را از طریق پیش‌بینی ترکیبی ارزیابی کرده و AllerTOP حساسیت‌ها و nonallergens را با ویژگی بالایی پیش‌بینی می‌کند. این امر باعث می‌شود که AllerTOP برنامه بسیار مفیدی برای پیش‌بینی واکنش متقابل آلرژن است [9].
بررسی توکسیسیتی اپی‌توپ‌های انتخابی
در مرحله بعدی باید اپی‌توپ‌های مورد مطالعه را از نظر میزان سمیت نیز بررسی کنیم که برای این کار از نرم‌افزار Toxinpred استفاده شد و اپی‌توپ‌های مربوط به T ،B را که مشکل سمیت نداشتن را انتخاب می‌کنیم.
پیکربندی ترکیب کایمر اولیه از واکسن اپی‌توپی طراحی‌شده
پس از چندین مرحله غربالگری اپیتوپها، حال باید پروتئین کایمر را که به‌عنوان سازه ایمنی‌زا (واکسن احتمالی) از اپی‌توپ‌هایی که غربالگری کردیم، ایجاد کنیم. برای انجام این کار اپی‌توپ‌های B ،T را کنار هم قرار گرفتند و توسط ترکیبات لینکر مانند KK به هم وصل شدند که در اتصالات اپیتوپها از لینکرهای منعطف استفاده می‌شود و پس از تکمیل ایجاد توالی کایمر اولیه به دو سر توالی کایمر ایجاد شده از اپی‌توپ‌های انتخاب‌شده، یک ترکیب ادجوانت مانند CTxB با کمک لینکرهای سخت مانند PAPAP اضافه شد تا ساختار سازه ایمنی‌زای اولیه ما تکمیل شود. از دیتابیس PDB برای تهیه توالی ادجوانت مورد نظر استفاده شد.
ارزیابی واکسن کایمر از نظر ساختاری و قابلیت اتصال به سلول‌های B و ترکیباتMHCI وII پس از ایجاد سازه ایمنی‌زای کایمری آن را قبل از ورود به فاز آزمایشگاهی باید از ابعاد مختلف دیگر مورد بررسی قرار داد که در ادامه به آنها می‌پردازیم.
بررسی ساختار دوبُعدی پروتئین واکسن کایمر
در مرحله اول باید سازه ایمنی‌زای کایمری خود را از لحاظ داشتن آلفا هلیکس و صفحات بتا و پیچ‌های تصادفی در ساختار دوم پروتئینی بررسی کنیم، زیرا وجود آلفا هلیکس بالای سه عدد فرایند بیان را برای کسانی که قصد کلون کردن دارند را دچار مشکل می‌کند. به همین دلیل برای بررسی این حالات باید به بررسی ساختار دوم پروتئین از طریق سرور PRABI و از طریق روش GORIV استفاده شد.
بررسی ساختار سه‌بُعدی واکسن مدل
در مرحله بعد باید ساختار سه‌بُعدی سازه ایمنی‌زای کایمری را بررسی کنیم، زیرا یک واکسن پپتیدی اگر بخواهد کارایی خوبی داشته باشد، باید ساختار سه‌بُعدی پایداری داشته باشد. به همین دلیل برای بررسی این ساختار از روش همولوژی مدلینگ و از سرور SWISSMODEL استفاده می‌کنیم و با بررسی sequence identity و local quality Estimate و QMEAN4 و ZSCORE بهترین مدل را برای محاسبات بعدی انتخاب می‌کنیم، اما اگر مدل انتخابی ما طی بررسی‌ها نیاز به refine کردن داشت از سرور دیگری به نام 3Drefine فرایند refine کردن را روی آن انجام می‌دهیم تا مدل‌های refine شده‌ای به دست آوریم که این مدل‌ها نسبت به قبلی ساختارش به ساختار طبیعی نزدیک‌تر است.
بررسی جایگاه امینواسیدها و پیوندها در مدل واکسن
حال پس از آنکه مدل مطلوب از سازه ایمنی‌زای کایمری به دست آمد، آن را باید از نظر باندها و جایگاه مطلوب امینواسیدها که از لحاظ فضایی در کجای پروتئین مورد بررسی ما قرار گرفته‌اند با استفاده از سرور PROCHECK و توسط تحلیل نمودار راماچانداران مورد بررسی قرار داده شد.
بررسی فیزیک و شیمیایی واکسن مدل
در این مرحله مدل پروتئینی سازه ایمنی‌زای کایمری به‌دست‌آمده باید از نظر خصوصیات فیزیک و شیمیایی مانند درصد و بار اسید امینه‌ها و وزن مولکولی و قطبیت و ضریب خاموشی و نیمه عمر و شاخص ناپایداری و حلالیت در آب و شاخص الیفاتیک نیز بررسی شوند. به همین دلیل برای این نوع از بررسی‌ها از سرورهای مختلفی مانند PEPCALC و protParam استفاده شد.
بررسی پایداری واکسن مدل
در ادامه ارزیابی‌های سازه ایمنی‌زای مدل‌شده اگر پروتئین مورد بررسی ما ناپایدار بود با کمک سرور دیگری به نام IUPRED2A آن را بررسی می‌کنیم که بخش‌های ناپایدار و disorder را در ساختار آن مشخص کنیم تا اگر خواستیم آن را اصلاح کنیم، بتوانیم راحت‌تر و با انتخاب امینواسیدها در موقعیت‌های نامنظم ساختار مدل سازه ایمنی‌زای اصلاحات لازم را انجام دهیم.
قابلیت اتصال به مجتمع اصلی سازگاری بافتی یا MHC
آخرین مرحله بررسی واکسن مورد نظرمان این است که بررسی کنیم که آیا واکسن طراحی شده ما قابلیت اتصال به MHCI و MHCII شناسایی توسط ایمنوگلوبین‌ها و سلول‌های B را دارد یا خیر.
پیش‌بینی اپی‌توپ سلول T
اپی‌توپ‌های پپتیدی نقش مهمی در تعیین واکسن دارند. مهم‌تر از همه این است که تشخیص آنها به شیوه Insilico هزینه و زمان را در مقایسه با روش‌های آزمایشگاهی مربوطه کاهش می‌دهد. با استفاده از ابزارهای قابل دسترسی برخط مانند IEDB ،Propred-1 و ابزار MCH2PRED، اپی‌توپ‌های CTL پروتئین هدف MHC کلاس I و MHC کلاس II را به ترتیب پیش‌بینی کرد. نتایج این ابزارها بسیار مهم است؛ زیرا از تعداد زیادی آلل HLA (آنتی‌ژن‌های انسانی-لکوسیتی) در طول محاسبه استفاده می‌کنند. توالی‌ها در قالبی ساده ارائه و همه آلل‌ها برای پیش‌بینی انتخاب شدند.
شناسایی اپی‌توپ سلول B
پیش‌بینی اپی‌توپ‌های بالقوه ایمنی در یک توالی پروتئین داده شده شاید به طور قابل توجهی تلاش آزمایشگاهی مرطوب مورد نیاز برای کشف اپی‌توپ‌های مورد نیاز برای طراحی واکسن‌ها و برای تشخیص ایمنی را کاهش دهد. هدف از پیش بینی اپی‌توپ سلول B یافتن آنتی‌ژن بالقوه‌ای است که می‌تواند با لنفوسیت‌های B تعامل داشته و یک پاسخ ایمنی مطلوب را آغاز کند. سپس اپی‌توپ‌های سلول B توسط IEDB به‌صورت برخط و بر اساس برخی روش‌های مبتنی بر سرور IEDB برای شناسایی آنتی‌ژن سلول B، شامل مقیاس آنتی‌ژن Kolaskar و Tongaonkar پیش‌بینی دسترسی به سطح Emini، پیش‌بینی انعطاف‌پذیری Karplus و Schulz و تجزیه و تحلیل پیش‌بینی اپی‌توپ خطی Bepipred و ابزار پیش‌بینی Chou و Fasman برای پیش‌بینی پیچ بتا استفاده شد [10, 11, 12 ,13 ,14].
در این مطالعه از پروتئین سنبله یا اسپایک کرونا ویروس که از مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی به دست آمد، برای طراحی استفاده شد و توالی امینو اسیدی قطعات انتخاب‌شده اپیتوپها، توسط سرور VAXIJEN و سرورهای AllerTOP و toxinpred بررسی شدند.
داکینگ مولکولی
برای بررسی این برهم‌کنش‌ها از روش داکینگ مولکولی توسط نرم‌افزارهای خاص مثل Cluspro استفاده شد تا از این روش بتوانیم جهت‌گیری صحیح دو مولکول مختلف (واکسن با MHCI و MHCII) را برای تشکیل یک کمپلکس پایدار را به دست آوریم. به همین دلیل برای این کار ساختارهای PDB مدل سازه ایمنی‌زای تولید‌شده را مورد بررسی و MHCهای شاخص برای کلاس I ،II را از دیتابیس RCSC تهیه کنیم و از طریق نرم‌افزارهایی مثل CONTEXT هترو اتم‌های MCHI و MHCII را حذف می‌کنیم.
آلل‌های فرکانس شاخص در جمعیت سفید پوست به نام‌های HLA-A0201 برای کلاس MHCI و HLA-DRB1-0101 برای کلاس MHCII را انتخاب کرده و توالی آنها نیز از RCSB تهیه شد و سپس هر‌کدام را جداگانه برای فرایند داکینگ وارد نرم‌افزار Cluspro برای بررسی اتصال با واکسن طراحی‌شده کردیم و آنها را از لحاظ سطح انرژی اتصالی بررسی کردیم و بهترین حالت‌های برهمکنش را در آنها به دست آوردیم. واکسن‌های مبتنی بر پپتیدها متنوع ساختاری میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا، امروزه یکی از گزینه‌های امیدوار‌کننده برای طراحی واکسن‌ها به شمار می‌آید.
یافته‌ها
تعیین اپی‌توپ‌های مورد نیاز برای تولید واکسن کایمر
در این مطالعه تعدادی توالی پپتیدی در اندازه‌های مختلف از پایگاه داده IEDB به‌عنوان کاندی‌های تولید پروتئین واکسن کایمری تهیه شد. سپس با کمک یک سری لینکر انعطاف‌پذیر به نام لینکرهای لیزین/لیزین (KK) توالی‌های اپی‌توپی به هم متصل شدند و در انتهای C و انتهای N توالی‌های پپتدی توسط لینکر سخت PAPAP توالی ادجوانت cholera B-subunit (CTxB) را که از پایگاه داده Uniport دریافت شده بودند، اضافه شد تا ساختار اولیه پروتئینی سازه ایمنی‌زای کایمر ایجاد شود. در این مرحله انتخاب توالی‌های پپتیدی و چیدمان آنها بسیار مهم است که سعی شد پپتیدهای مربوط به سلول‌های B ،T را هر کدام کنار هم قرارداده شود و به همدیگر متصل شوند.
نتایج بررسی آنتی‌ژنسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
در مرحله اول پس از آنکه با استفاده سرور IEDB آنتی‌ژن‌های مورد نظر را از بررسی توالی امینواسیدی پروتئین اسپایک کرونا ویروس به دست آورده شد. تک تک این اپی‌توپ‌های پپتیدی را از طریق نرم‌افزار VAXIJEN برای تعیین خاصیت آنتی‌ژنسیته مورد بررسی قرار گرفتند و از بین آنها هشت عدد که دارای ویژگی آنتی‌ژنسیته مطلوب‌تری بودند، انتخاب شدند که در بین آنها کمترین و بیشترین امتیاز 0.4710 و 0.9116 را از سرور VAXIJEN به خود اختصاص دادند. نمرات به‌دست‌آمده حاکی از ماهیت آنتی‌ژنتیکی توالی پروتئین سازه ایمنی‌زا ایجاد شده است. به همین دلیل از این توالی‌ها برای طراحی سازه ایمنی‌زای مولتی اپی‌توپ استفاده شده است [8].
نتایج بررسی آلرژیسیته اپی توپهای انتخابی
پس از بررسی ویژگی آنتی‌ژنسیته اپی‌توپ‌های منتخب حال نوبت به بررسی خاصیت الرژنسیته آنها است. به‌طور کلی سازه ایمنی‌زای آلرژیک می‌تواند باعث ایجاد واکنش‌های ایمنی واکنشی متقاطع خاص آلرژن در بدن میزبان مانند بثورات پوستی و تورم غشاهای مخاطی شود. به همین دلیل در این مرحله تمام آنها جداگانه و تک تک با کمک نرم‌افزار ALLerTPv.2.0 ارزیابی شدند و مواردی از اپیتوپها که ریسک آلرژیایی داشتند، حذف شدند و آن‌هایی را که فاقد ویژگی آلرژیایی بودند، برای سنتز سازه ایمنی‌زا جدا شدند تا بررسی‌های بعدی در مورد آنها انجام شود [15, 16].
نتایج بررسی توکسیسیته اپی‌توپ‌های انتخابی
در این مرحله و در ادامه ارزیابی‌های سازه ایمنی‌زا باید تک تک اپی‌توپ‌های پیشنهادی که در دو مرحله قبل از لحاظ آنتی‌ژنسیته و آلرژیایی بررسی شدن را از لحاظ سمیت و توکسسیتی و با کمک نرم‌افزار Toxinpred مورد ارزیابی قرار گیرند و پس از آنکه اپی‌توپ‌های مورد نظر از لحاظ توکسیسیته بی‌خطر بودند، به جداسازی هشت عدد از آنها برای تولیدسازه ایمنی‌زای کایمر که به‌عنوان ترکیب اولیه واکسن محسوب می‌شود، پرداخته شود [17].
نتایج پیکربندی و طراحی ساختار اولیه پروتئین کایمر واکسن
در این مرحله از طراحی سازه ایمنی‌زا باید اپی‌توپ‌های پپتیدی که در مراحل قبلی آنالیز جداسازی شدند به همدیگر متصل شوند تا توالی ساختار اولیه سازه ایمنی‌زای کایمر شکل بگیرد. به همین دلیل در این مرحله ابتدا اپیتوپها باید کنار هم قرار داده شوند و بین آنها از لینکرهای لیزین/لیزین برای اتصال استفاده شود. سپس از طریق پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی توالی ادجوانت (cholera toxinB subunite) مورد نیاز را به دست آورده و با کمک لینکر سخت PAPAPبه انتهای N و انتهای C توالی سازه ایمنی‌زای کایمر متصل شد (البته در به دست آوردن توالی ادجوانت باید دقت شود که از نمونه‌های partial نباشد) که با این کار ساختار اولیه توالی‌های سازه ایمنی‌زای کایمر جهت بررسی‌های بعدی ایجاد شد.
نتایج ارزیابی ساختار دوبُعدی و سه‌ُبعدی سازه ایمنی‌زا
در ادامه ارزیابی ترکیب سازه ایمنی‌زای تولید‌شده، از نظر ساختار دوبُعدی و سه‌بُعدی بررسی شد که اگر در ساختار ان تاخوردگی‌های نامطلوب ایجاد شود در همین ابتدای کار آن بخش‌های اپی‌توپی برهم‌زننده ساختار سازه ایمنی‌زا را از ساختار اولیه آن حذف کرد. به همین دلیل ابتدا با کمک نرم‌افزار prabi و با استفاده از روش GORIV ساختار دوم سازه ایمنی‌زا بررسی شد و نتایج حاصل از این بررسی این‌گونه بود که ساختار دوم ترکیب سازه ایمنی‌زا از نظر درصد آلفا هلیکس 43.21 درصد بود. درصد بالای آلفا هلیکس بعداً در فرایندهای کلونینگ اگر شخصی محقق بخواهد کارهای کلونینگ کند، مشکل‌ساز می‌شود (تصویر شماره 1).
در ادامه ساختار سه‌بُعدی 3D را باید به دست آورد و چون از ترکیب سازه ایمنی‌زای ما هیچ ساختاری وجود ندارد، پس باید از روش همولوژی مدلینگ و با استفاده از سرور SWISSMODEL استفاده شود. با ورود توالی پروتئین سازه ایمنی‌زا در این سرور به عنوان الگو استفاده شد تا یک سری ترکیب با توالی پپتیدی شبیه به سازه ایمنی‌زای سنتز‌شده پیدا شود. سپس با بررسی چندین شاخص در این مدل‌های ارائه‌شده مثل seq identity Local Quality Estimate و zscore ،comparison میزان شباهت مدل سازه ایمنی‌زا مورد بررسی به ترکیبات طبیعی موجود در این سرور به دست آمد، بدین‌گونه که شاخص seq comparison با عدد 83.33 درصد بود.
همچنین در تصویر شماره 2 شاخص‌های Local Quality Estimate ،zscore و comparison نیز بیانگر شباهت ترکیب مدل سه‌بُعدی ارائه‌شده توسط سرور SWISSMODEL بر اساس الگوی توالی پروتئین سازه ایمنی‌زاس طراحی‌شده مورد مطالعه است [18, 19].
همچنین در تصویر شماره 2 شاخص‌های Local Quality Estimate ،zscore و comparison نیز بیانگر شباهت ترکیب مدل سه‌بُعدی ارائه‌شده توسط سرور SWISSMODEL بر اساس الگوی توالی پروتئین سازه ایمنی‌زاس طراحی‌شده مورد مطالعه است [18, 19].
اگر هنگام بررسی مدل مورد نظر سه‌بُعدی مشخص شود مدل مربوطه از لحاظ شاخص‌های ذکر‌شده کیفیت مطلوبی ندارد، باید آن را اصلاح کرد که برای این کار از نرم‌افزار 3DRefin مدل به‌دست‌آمده سازه ایمنی‌زا را Refin کرده تا مدلی Refin شده و با کیفیت مطلوب‌تر را در اختیار قرار گیرد.
در ادامه فرایند بررسی باید مدلی را که طی فرایند همولوژی مدلینگ از سازه ایمنی‌زا به دست آمده است، از نظر قرارگیری اسید آمینه‌ها در جایگاه مطلوب و پرخطر مدل سازه ایمنی‌زا قرار دارد، بررسی شود که این کار به وسیله نرم‌افزار PROcheck از طریق بررسی نمودار راماچاندران انجام شد و مشاهده شد که حدود 93.7 درصد از امینواسیدهای ترکیب مدل واکسن مورد مطالعه در مناطق مطلوب و 5.9 درصد در مناطق مجاز و 0.4 درصد در مناطق تقریباً مجاز و صفر درصد در مناطق غیرمجاز سازه ایمنی‌زا قرار داشت [20]. همچنین با کمک سرور ProSA تمام اتم‌های کربن آلفا سازه ایمنی‌زا بررسی شدند و نتایج حاصل از ان در قالب Z score که برابر 5.65- بود، به دست آمد (تصویر شماره 3).
در ادامه فرایند بررسی باید مدلی را که طی فرایند همولوژی مدلینگ از سازه ایمنی‌زا به دست آمده است، از نظر قرارگیری اسید آمینه‌ها در جایگاه مطلوب و پرخطر مدل سازه ایمنی‌زا قرار دارد، بررسی شود که این کار به وسیله نرم‌افزار PROcheck از طریق بررسی نمودار راماچاندران انجام شد و مشاهده شد که حدود 93.7 درصد از امینواسیدهای ترکیب مدل واکسن مورد مطالعه در مناطق مطلوب و 5.9 درصد در مناطق مجاز و 0.4 درصد در مناطق تقریباً مجاز و صفر درصد در مناطق غیرمجاز سازه ایمنی‌زا قرار داشت [20]. همچنین با کمک سرور ProSA تمام اتم‌های کربن آلفا سازه ایمنی‌زا بررسی شدند و نتایج حاصل از ان در قالب Z score که برابر 5.65- بود، به دست آمد (تصویر شماره 3).
نتایج بررسی خواص فیزیکی و شیمیایی
در این مرحله از ارزیابی واکسن مورد نظر یک سری از ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی در آن توسط نرم‌افزارهایی مانند protparam و pepcalc ارزیابی شد که حاصل آن بدین‌گونه بود که ترکیب واکسن مورد بررسی دارای شاخص ناپایداری 33.93 بود که حاکی از آن است که ترکیبی پایدار در بدن میزبان است و نیمه عمری حدود سی ساعت در بدن پستانداران دارد.
همچنین وزن مولکولی و PH ایزوالکتریک آن به ترتیب 40884.70 و 9.68 بود. این ترکیب ایمنی‌زا دارای ضریب گراویتی و الیفاتیکی به ترتیب 0.366- و 90.48 بود و حلالیت آن مناسب تشخیص داده شد. همچنین ضریب خاموشی آن در آب و در طول موج 280 نانومتر 35090 جهت ورود به فاز آزمایشگاهی تشخیص داده شد (تصویر شماره 4) [21, 22].
در این مرحله از ارزیابی واکسن مورد نظر یک سری از ویژگی‌های فیزیکی و شیمیایی در آن توسط نرم‌افزارهایی مانند protparam و pepcalc ارزیابی شد که حاصل آن بدین‌گونه بود که ترکیب واکسن مورد بررسی دارای شاخص ناپایداری 33.93 بود که حاکی از آن است که ترکیبی پایدار در بدن میزبان است و نیمه عمری حدود سی ساعت در بدن پستانداران دارد.
همچنین وزن مولکولی و PH ایزوالکتریک آن به ترتیب 40884.70 و 9.68 بود. این ترکیب ایمنی‌زا دارای ضریب گراویتی و الیفاتیکی به ترتیب 0.366- و 90.48 بود و حلالیت آن مناسب تشخیص داده شد. همچنین ضریب خاموشی آن در آب و در طول موج 280 نانومتر 35090 جهت ورود به فاز آزمایشگاهی تشخیص داده شد (تصویر شماره 4) [21, 22].
نتایج بررسی پیش‌بینی برهمکنش با سلول‌های B
در این مرحله روش‌های مبتنی بر مقیاس اسید آمینه برای شناسایی اپی‌توپ‌های سلول B بالقوه پیش‌بینی استفاده شد. پیش‌بینی برهمکنش اپیتوپها با سلول‌های B ایمنی با کمک نرم‌افزار IEDB صورت گرفت که یکی از بهترین روش‌های پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول B است [25 ،8]. طی این مرحله از روش‌های مختلف تحلیل نرم‌افزار IEDB برای پیش‌بینی اپی‌توپ سلول پیوسته B استفاده شد.
در روش پیش‌بینی آنتی‌ژن Kolaskar و Tongaonkar32 آنتی‌ژن بر اساس خصوصیات فیزیولوژیکی اسیدهای آمینه و فراوانی در اپی‌توپ‌های شناختهشده تجربی بررسی شد. متوسط گرایش آنتی‌ژن پروتئین 1.07 است، حداکثر 1.13 و حداقل 1.05 آستانه تعیین آنتی‌ژن برای پروتئین 1.02 بود. همه مقادیر بیشتر از 1.00 تعیین‌کننده توان بالقوه آنتی‌ژنی آنها بود. به همین دلیل نتیجه آن شد که از بین آنها چهار اپی‌توپ مقدار آستانه تعیین‌شده قبلی را دارند و آنها توانایی بیان پاسخ سلول B را دارا هستند (تصویر شماره 5).
در این مرحله روش‌های مبتنی بر مقیاس اسید آمینه برای شناسایی اپی‌توپ‌های سلول B بالقوه پیش‌بینی استفاده شد. پیش‌بینی برهمکنش اپیتوپها با سلول‌های B ایمنی با کمک نرم‌افزار IEDB صورت گرفت که یکی از بهترین روش‌های پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول B است [25 ،8]. طی این مرحله از روش‌های مختلف تحلیل نرم‌افزار IEDB برای پیش‌بینی اپی‌توپ سلول پیوسته B استفاده شد.
در روش پیش‌بینی آنتی‌ژن Kolaskar و Tongaonkar32 آنتی‌ژن بر اساس خصوصیات فیزیولوژیکی اسیدهای آمینه و فراوانی در اپی‌توپ‌های شناختهشده تجربی بررسی شد. متوسط گرایش آنتی‌ژن پروتئین 1.07 است، حداکثر 1.13 و حداقل 1.05 آستانه تعیین آنتی‌ژن برای پروتئین 1.02 بود. همه مقادیر بیشتر از 1.00 تعیین‌کننده توان بالقوه آنتی‌ژنی آنها بود. به همین دلیل نتیجه آن شد که از بین آنها چهار اپی‌توپ مقدار آستانه تعیین‌شده قبلی را دارند و آنها توانایی بیان پاسخ سلول B را دارا هستند (تصویر شماره 5).
به‌طور کلی برای اینکه یک اپی‌توپ محرک قدرتمندی برای سلول B باشد، باید از سطح دسترسی خوبی برخوردار باشد که برای تشخیص این ویژگی از پیش‌بینی دسترسی به سطح Emini استفاده شد که در نتایج حاصله مشخص شد منطقه 10 تا 15و 45 تا 50 و 65 تا 70 باقی‌مانده اسیدهای آمینه در دسترس‌تر است (تصویر شماره 5).
مناطق حاوی پیچ بتا معمولاً در دسترس و طبیعتاً آب‌گریز هستند که این دو خاصیت از نواحی آنتی‌ژنی یک پروتئین هستند که بر اساس مدل ارزیابی Chou and Fasman و از طریق بررسی پیچ‌های بتا قابل بررسی است [24]. منطقه 25-10 ، 30-40، 80-85 و 90-110 به‌عنوان یک منطقه بتا چرخش در نظر گرفته شد. همچنین بر اساس شواهد تجربی، مشخص شده که انعطاف‌پذیری یک پپتید با آنتی‌ژنیسیته آن مرتبط است. از این‌رو، روش پیش‌بینی انعطاف‌پذیری Karplus و Schulz نیز بر این مبنا شکل گرفت و از آن برای بررسی انعطاف‌پذیری اپی‌توپ‌های سازه ایمنی‌زا استفاده شد. در این روش پیش‌بینی، مشخص شد مناطق 17-11، 47 تا 53، 67 تا 87 و 95 تا 105 انعطاف‌پذیر‌ترین بخش سازه ایمنی‌زای مورد مطالعه هستند (تصویر شماره 6).
مناطق حاوی پیچ بتا معمولاً در دسترس و طبیعتاً آب‌گریز هستند که این دو خاصیت از نواحی آنتی‌ژنی یک پروتئین هستند که بر اساس مدل ارزیابی Chou and Fasman و از طریق بررسی پیچ‌های بتا قابل بررسی است [24]. منطقه 25-10 ، 30-40، 80-85 و 90-110 به‌عنوان یک منطقه بتا چرخش در نظر گرفته شد. همچنین بر اساس شواهد تجربی، مشخص شده که انعطاف‌پذیری یک پپتید با آنتی‌ژنیسیته آن مرتبط است. از این‌رو، روش پیش‌بینی انعطاف‌پذیری Karplus و Schulz نیز بر این مبنا شکل گرفت و از آن برای بررسی انعطاف‌پذیری اپی‌توپ‌های سازه ایمنی‌زا استفاده شد. در این روش پیش‌بینی، مشخص شد مناطق 17-11، 47 تا 53، 67 تا 87 و 95 تا 105 انعطاف‌پذیر‌ترین بخش سازه ایمنی‌زای مورد مطالعه هستند (تصویر شماره 6).
سرانجام، ابزار پیش‌بینی اپی‌توپ خطی Bepipred استفاده شد که این برنامه بر اساس یک مدل Hidden Markov عمل می‌کند که این روش واحد برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های سلول B خطی به شمار می‌آید که با مراجعه به همه داده‌ها پیش‌بینی شد که توالی‌های پپتید سازه ایمنی‌زا از اسیدهای آمینه 7 تا 20 و 25 تا 40 و 65 تا 110 قادر به القای پاسخ ایمنی مورد نظر به‌عنوان اپی‌توپ سلول‌های B هستند (تصویر شماره 7).
نتایج بررسی پیش‌بینی برهمکنش با MHCI و MHCII
در این مرحله از کار از سرورهای Propred-I و MHC2pred برای پیش‌بینی اپیتوپها توسط سلول T استفاده شدند. Propred-I از یک روش پایه ماتریس برای اسکن و پیش‌بینی پپتیدها در برابر کتابخانه از آلل‌های کلاس MHCI و MHC2pred برای آلل‌های کلاس MHCII استفاده شدند. توالی پپتیدها با فرمت FASTA به این سرورها، در حالی که انتخاب همه آلل‌ها با پپتید با امتیاز بالاتر و با آستانه 4 درصد بر روی آنها انجام شد [26, 27, 28].
علاوه بر این، غربالگری ایمونوژنسیته و توکسوسیته و آنتی‌ژنسیته اپیتوپها انجام شد و فقط تعداد اندکی از اپی‌توپ‌های انتخابی برای پردازش بعدی بر اساس نمره آنتی‌ژنی خود انتخاب شدند. سپس از بین آنها چند مورد که برهمکنش خوبی با MHCI و MHCII ،B داشتند، جدا و در یک جدول جداگانه دسته‌بندی شدند، زیرا آنها اپی‌توپ‌هایی بودند که نسبت به بقیه، بیشترین نقش را در تحریک و ایجاد ایمنی در بدن شخص میزبان به واسطه سازه ایمنی‌زای تولید‌شده از آنها نقش ایفا می‌کردند (جدول شماره 1).
.jpg)
نتایج داکینگ
در این مرحله از کار پس از آنکه فایل‌های ورودی وارد نرم‌افزار Cluspro شد، نرم‌افزار لیگاند را با 70 هزار چرخش می‌‌چرخاند. برای هر چرخش، لیگاند را به نسبت x ،y ،z نسبت به گیرنده روی یک شبکه تفسیر می‌کنیم و تفسیر را با بهترین امتیاز از هر چرخش انتخاب می‌کند. نرم‌افزار از میان 70 هزار چرخش، 1000 ترکیب چرخش را انتخاب می‌کند که کمترین امتیاز را دارند. سپس یک گروه‌بندی سختگیرانه از این 1000 موقعیت لیگاند را با شعاع نُه آنگستروم C-alpha rmsd انجام می‌دهد.
این بدان معنا است که در نُه زاویه موقعیت لیگاند با بیشترین «همسایگان» را می‌یابد و آن را به یک مرکز خوشه تبدیل می‌کند و اعضای آن را با لیگاند مورد مطالعه مجاور می‌کند. سپس این‌ها از مجموعه حذف می‌شوند و ما به دنبال یک مرکز خوشه دوم خواهیم بود. همین‌طور این فرایند ادامه می‌یابد و بهترین مدل‌ها را با ،سطح انرژی مناسب برای برهمکنش بین رسپتور و لیگاند ایجاد می‌کند (تصویر شماره 8).
در این مرحله از کار از سرورهای Propred-I و MHC2pred برای پیش‌بینی اپیتوپها توسط سلول T استفاده شدند. Propred-I از یک روش پایه ماتریس برای اسکن و پیش‌بینی پپتیدها در برابر کتابخانه از آلل‌های کلاس MHCI و MHC2pred برای آلل‌های کلاس MHCII استفاده شدند. توالی پپتیدها با فرمت FASTA به این سرورها، در حالی که انتخاب همه آلل‌ها با پپتید با امتیاز بالاتر و با آستانه 4 درصد بر روی آنها انجام شد [26, 27, 28].
علاوه بر این، غربالگری ایمونوژنسیته و توکسوسیته و آنتی‌ژنسیته اپیتوپها انجام شد و فقط تعداد اندکی از اپی‌توپ‌های انتخابی برای پردازش بعدی بر اساس نمره آنتی‌ژنی خود انتخاب شدند. سپس از بین آنها چند مورد که برهمکنش خوبی با MHCI و MHCII ،B داشتند، جدا و در یک جدول جداگانه دسته‌بندی شدند، زیرا آنها اپی‌توپ‌هایی بودند که نسبت به بقیه، بیشترین نقش را در تحریک و ایجاد ایمنی در بدن شخص میزبان به واسطه سازه ایمنی‌زای تولید‌شده از آنها نقش ایفا می‌کردند (جدول شماره 1).
نتایج داکینگ
در این مرحله از کار پس از آنکه فایل‌های ورودی وارد نرم‌افزار Cluspro شد، نرم‌افزار لیگاند را با 70 هزار چرخش می‌‌چرخاند. برای هر چرخش، لیگاند را به نسبت x ،y ،z نسبت به گیرنده روی یک شبکه تفسیر می‌کنیم و تفسیر را با بهترین امتیاز از هر چرخش انتخاب می‌کند. نرم‌افزار از میان 70 هزار چرخش، 1000 ترکیب چرخش را انتخاب می‌کند که کمترین امتیاز را دارند. سپس یک گروه‌بندی سختگیرانه از این 1000 موقعیت لیگاند را با شعاع نُه آنگستروم C-alpha rmsd انجام می‌دهد.
این بدان معنا است که در نُه زاویه موقعیت لیگاند با بیشترین «همسایگان» را می‌یابد و آن را به یک مرکز خوشه تبدیل می‌کند و اعضای آن را با لیگاند مورد مطالعه مجاور می‌کند. سپس این‌ها از مجموعه حذف می‌شوند و ما به دنبال یک مرکز خوشه دوم خواهیم بود. همین‌طور این فرایند ادامه می‌یابد و بهترین مدل‌ها را با ،سطح انرژی مناسب برای برهمکنش بین رسپتور و لیگاند ایجاد می‌کند (تصویر شماره 8).
نتیجه‌گیری
به‌طور کلی طی نتایج حاصله و در بررسی خصوصیات فیزیک و شیمیایی توسط نرم‌افزارهایی مانند protparam و pepcalc حاصل آن بدین‌گونه ترکیب سازه ایمنی‌زای مورد بررسی دارای شاخص ناپایداری 33.93 بود که عددی زیر چهل است که حاکی از آن است که ترکیبی پایدار است و نیمه عمری حدود سی ساعت در بدن پستانداران دارد که این فرصت آن را در بدن ایجاد می‌کند که ایمنی مطلوب‌تری شکل بگیرد.
همچنین وزن مولکولی و PH ایزوالکتریک آن به ترتیب 40884.70 و 9.68 بود که بیانگر شرایط مطلوب سازه ایمنی‌زا هستند. این ترکیب ایمنی‌زا دارای ضریب گراویتی و الیفاتیکی به ترتیب 0.366- و 90.48 بود و حلالیت آن در بدن مناسب تشخیص داده شد. همچنین ضریب خاموشی آن در آب و در طول موج 280 نانومتر 35090 بود و مناسب برای ورود به فاز آزمایشگاهی تشخیص داده شد [21, 22].
با توجه به ساختار دوم ترکیب سازه ایمنی‌زا از نظر درصد آلفا هلیکس با 43.21 درصد بود. درصد بالای آلفا هلیکس در فرایندهای کلونینگ، بعداً اگر محققی بخواهد کارهای کلونینگ کند، مشکل‌ساز می‌شود و نیز درصد نسبتاً پایین آلفا هلیکس‌ها خاصیت تجمعی‌تر این سازه را توضیح می‌دهد.
در مورد ساختار سوم با کمک سرور SWISSMODEL یک مدل مشخص برای کایمر پیشگویی کرد که به منظور ارزیابی کیفیت مدل مورد نظر از نقشــه راماچاندران استفاده شــد. زوایای چرخش phi و psi برای همه باقی‌مانده‌های ساختار پروتئین در محورهای X و Y قابل مشــاهده اســت. زاویه phi چرخش را حول باند N اســیدآمینه نشــان می‌دهد، در حالی که زاویــه psi چرخش راحول باند Calpha-C مشــخص می‌کند.
از آنجا که پلی‌پپتیدها فرایند تاخوردگی را متحمل می‌شوند، زوایای phi و psi در محدوده چرخش 180- تا 180+ درجه بســته به نوع زنجیره جانبی اســید آمینه قرار می‌گیرند. ترکیباتی که اتم‌ها در آن در فاصله‌ای نزدیک‌تر از مجموع شــعاع واندروالسی آنها قرار می‌گیرند، نواحی غیرمجاز یا پرت نقشه را می‌سازند. قرارگیــری در ایــن نواحی برای همه اســید آمینه‌ها به غیر از گلایســین از نظر برخورد فضایی ممکن نیســت. گلایســین به علت نداشتن زنجیره جانبی محدودیت ســایر اســید آمینه‌ها را نداشــته و در تمام نقاط نقشه، به‌خصوص نواحی مخصوص دورها در ساختار دوم که برای سایرین ممنوع اســت، می‌تواند قرار بگیرد.
مکان این اســید آمینه در نقشه حاصل از سرور PROCHECK با علامت مثلث قابل تشخیص است و در محاسبات آماری لحاظ نمی‌شــود. درصــد باقی‌مانده‌ها در ناحیه مطلوب راهنمای خوبی برای ارزیابی کیفیت استریوشیمیایی ساختار است. از طریق بررسی نمودار راماچاندران مشاهده شد که حدود 93.7 درصد از آمینواسیدهای ترکیب مدل واکسن مورد مطالعه در مناطق مطلوب و 5.9 درصد در مناطق مجاز و 0.4 درصد در مناطق تقریباً مجاز و صفر درصد در مناطق غیرمجاز سازه ایمنی‌زا قرار داشت [20].
همچنین با کمک سرور ProSA تمام اتم‌های کربن آلفا سازه ایمنی‌زا بررسی شدند و نتایج حاصل از آن در قالب Z score که 5.65- بود، به دست آمد که عددی مطلوب برای سازه ایمنی‌زا محسوب می‌شود. مقدار درصد جایگاه امینواسیدها در ســرور PROCHECK بالای 90 درصد، برای یک ساختار پایدار با بررســی کریستالوگرافی ساختارهای پروتئینی شناخته شده، مورد انتظار است.
توانایی تشــخیص اپیتوپها در پاســخ ایمنــی، کاربرد مهمی در تشــخیص بیمــاری دارد و در‌نتیجــه از گام‌های اساســی در مطالعات ایمونوبیوانفورماتیک شناســایی و نقشــه‌برداری آنها محســوب می‌شود. اپیتوپها، گروه‌های تعریف‌شده‌ای از اسیدهای آمینه هستند که در ترکیب یک پروتئین قرار دارند و پاسخ ایمنی را به وسیله برهمکنش بــا گیرنده‌های یاخته T و B فعال می‌کنند.
در اینجا، ما توسعه واکسن مبتنی بر اپی‌توپ را بررسی کردیم که پروتئین اسپایک را هدف قرار می‌دهد و از پروتئین اسپایک سلول‌های اپی‌توپی پروتئینی مبتنی بر سلول‌های T که شاید پاسخ ایمنی را در میزبان ترویج دهند، با استفاده از سرورهای Propred-I و MHC2pred بررسی و شناسایی شدند. تجزیه و تحلیل‌ها در سطح ساختاری پروتئین اولیه، ثانویه و سوم روی آنها انجام شد که اپی‌توپ‌های کلاس MHC-I (VGYLQPRTFLLKYNE و YVGYLQPRTFLLKYN و GINITRFQTLLALHR) و در کلاس MHC-II (YVGYLQPRTFLLKYN و GINITRFQTLLALHR و LNRALTGIAVEQDKN) با آلل‌های بیشتری از HLA در تعامل بودن و از نظر طبیعت بسیار آنتی‌ژن‌تر هستند [40].
اپی‌توپ‌های محافظت‌شده سلول‌های B توسط سرور IEDB تجزیه و تحلیل و پیش‌بینی شدند. از ابزارهای دیگر در IEDB برای تحلیل آنتی‌ژنی، انعطاف‌پذیری، دسترسی به حلال و پیوندهای دی سولفید استفاده شد که نواحی 7 تا20، 65 تا 75 و 90 تا 110 سازه ایمنی‌زا مورد بررسی نمره ایمنی بالاتری به نسبت به دیگر بخش‌های آن به دست آورد و این نواحی می‌توانند نماینده بالقوه احتمالی بهتری در سلول‌های B برای نامزد برای تولید واکسن باشند. از سرور دیسکوپ برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های ناپیوسته استفاده شد.
رویکرد اطلاعاتی ایمنی می‌تواند اپی‌توپ‌های بسیار محافظت‌‌شده‌ای را شناسایی کند که ممکن است محافظت گسترده‌ای در برابر سویه‌های مختلف داشته باشد. بر اساس نمره ایمنی و حفظ توالی مشخص است که پپتیدهای محافظت‌شده احتمالاً ایمن هستند.
علاوه بر این، ساختارهای سه‌بُعدی از هر پپتیدهای اتصال‌دهنده کلاس MHC از طریق داکینگ پیش‌بینی برهمکنش آلل HLA-A0201 انسانی با کلاس MHCI و آلل HLA-DRB1-0101 انسانی با کلاس MHCII انجام شد. بر اساس نتایج داکینگ، پتانسیل اتصال و نمره ایمنی، پپتیدهای شناسایی‌شده، شاید در مطالعه حاضر در قیاس با برخی پپتیدهایی که در مطالعات دیگر بررسی شده بودند، ایمنی مطلوب‌تری داشته باشند [41, 42 ,39].
اپی‌توپ‌های پیش‌بینی‌شده باید در مطالعات بعدی برای قدرت درمانی آزمایش شوند. پیش‌بینی می‌کنیم که اپی‌توپ‌های مورد بررسی دارای پتانسیل درمانی با دامنه مطلوبی باشند. تجزیه و تحلیل انفورماتیک ایمنی ما اپی‌توپ‌های T و سلول‌های B راهکاری جدید و با پشتوانه قوی بر اساس الگوریتم‌های محاسباتی است که این ممکن است به توسعه واکسن‌های مبتنی بر پپتیدهای قوی برای پرداختن به چالش قریب‌الوقوع کوید-19 کمک کند.
توسعه واکسن‌های جدید و به موقع برای دفاع از بار جهانی در حال افزایش بیماری‌ها، بسیار مهم است. با پیشرفت فناوری مبتنی بر توالی‌یابی، اکنون اطلاعات کافی در مورد ژنومیک و پروتئومیک ویروس‌های مختلف وجود دارد. درنتیجه، امروزه با کمک ابزارهای مختلف بیوانفورماتیک می‌توان واکسن‌های پپتیدی را بر اساس اپی‌توپ مختلف طراحی کرد.
در پژوهش‌های مختلف طراحی واکسن مبتنی بر اپی‌توپ علیه ویروس‌هایی مانند ویروس تب دنگو، ویروس چیکونگونیا، ویروس آنسفالیت سنت لوئیس و موارد دیگر صورت گرفته است [28, 29 ,30 ,31]. اگرچه طراحی واکسن مبتنی بر اپی‌توپ تبدیل به یک مفهوم آشنا شده است، اما در مورد HCoV هنوز کار زیادی انجام نشده است. HCoV یک ویروس دارای RNA است که به خاطر فقدان سیستم ترمیم بیشتر از ویروس‌های دارای DNA جهش می‌یابد و این نوع جهش‌ها بیشتر در پروتئین غشای خارجی، یعنی پروتئین سنبله یا اسپایک رخ می‌دهد.
این نوع جهش‌ها منجر به فرار آنها از پاسخ‌های ایمنی سلولی و هومورال و باعث افزایش پایداری HCoVها در بدن میزبان می‌شوند [32, 33, 34]. به همین دلیل پروتئین سنبله یا اسپایک به دلیل توانایی در ایجاد پاسخ ایمنی مخاطی سریع‌تر و طولانی‌مدت‌تر نسبت به سایر پروتئین‌ها، بیشترین پتانسیل را به‌عنوان هدف برای طراحی واکسن‌ها دارد. به همین دلیل، محبوبیت زیادی در بین محققان به دست آورده است [35, 36]. از این نظر، باید یک واکسن مناسب HCoV طراحی شود تا بر عوارض جانبی این عفونت ویروسی غلبه کند [37].
در حال حاضر، واکسن‌ها بیشتر مبتنی بر مصونیت سلول B است، اما اخیراً واکسن‌های مبتنی بر اپی‌توپ سلول T ایجاد شده است، زیرا میزبان می‌تواند پاسخ ایمنی قوی سلول CD8+T را علیه سلول آلوده تولید کند. با گذشت زمان، به دلیل رانش آنتی‌ژن، هر ذره خارجی می‌تواند از سلول‌های خاطره ایمنی آنتی‌بادی فرار کند.
با این حال، پاسخ ایمنی سلول T اغلب ایمنی طولانی‌مدتی فراهم می‌کند. در اینجا، اپی‌توپ‌های سلول B و سلول‌های T را برای بررسی پیش‌بینی مصونیت به روش‌های مختلف استفاده کردیم، اما سایر مطالعات اخیر در مورد HCoV فقط نشان‌دهنده اپی‌توپ سلول T است و ما می‌خواهیم یافته‌های بیشتر خود را در اینجا بیان کنیم.
معیارهایی مختلفی وجود دارد که باید توسط یک اپی‌توپ داوطلب واکسن برآورده شود. با این حال، آلرژی‌زایی یکی از موانع برجسته در تولید واکسن است. امروزه، بیشتر واکسن‌ها سیستم ایمنی بدن را به یک واکنش «آلرژیک»، از طریق القای سلول‌های T کمک‌کننده (Th2) و ایمونوگلوبولین E (IgE) تحریک می‌کنند. طبق ارزیابی برنامه سازمان غذا و کشاورزی و سازمان بهداشت جهانی از پیش‌بینی آلرژی‌زایی، یک توالی به طور بالقوه اگر هویت حداقل شش اسید آمینه متعارف یا 0.35 آلرژی‌زا داشته باشد، حساسیت‌زا است.
از این رو، اپی‌توپ‌های مورد بررسی ما معیارهای ارزیابی سازمان غذا و کشاورزی و سازمان بهداشت جهانی از پیش‌بینی آلرژی را برآورده نمی‌کند و توسط این طرح به‌عنوان یک غیر‌آلرژن طبقه‌بندی می‌شود [40] و به همین دلیل، پیشنهاد کردیم که اپی‌توپ پیشنهادی بتواند پاسخ ایمنی مؤثر را به‌عنوان واکسن پپتید در داخل بدن ایجاد کند.
مطالعه ما نشان داده است رویکردهای محاسباتی یکپارچه می‌تواند برای پیش‌بینی کاندیداهای سازه‌های ایمنی‌زا (واکسن)علیه پاتوژن‌ها، ازجمله HCoV با روش‌های معتبر که قبلاً توصیف شده، مورد استفاده قرار گیرد. به این ترتیب، در مطالعات اینسیلیکو هم در زمان و هم هزینه برای محققان صرفه‌جویی می‌شود و می‌تواند کار آزمایشی را با احتمال بیشتری برای پیدا کردن راه‌حل‌های مورد نظر و با آزمایش‌های کمتری و تکرار خطاها از سنجش‌ها هدایت کند.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
تمامی اصول اخلاقی در این مقاله در نظر گرفته شده است. شرکت کنندگان در جریان هدف تحقیق و مراحل اجرای آن قرار گرفتند. آنها از محرمانه بودن اطلاعات خود اطمینان داشتند.اصول کنوانسیون هلسینکی نیز رعایت شد.
حامی مالی
این تحقیق هیچ کمک مالی از سازمان های مالی در بخش های عمومی، تجاری یا غیر انتفاعی دریافت نکرد و یک طرح شخصی می‌باشد.
مشارکت نویسندگان
همه نویسندگان استانداردهای نگارش استاندارد را بر اساس توصیه های کمیته بین المللی ناشران مجلات پزشکی رعایت کردند.
تعارض منافع
هیچ‌گونه تعارض منافعی در نگارش این مقاله وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
از اساتید دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز که همکاری لازم را برای تهیه این کار تحقیقاتی داشتند، تقدیر و تشکر می‌شود.
به‌طور کلی طی نتایج حاصله و در بررسی خصوصیات فیزیک و شیمیایی توسط نرم‌افزارهایی مانند protparam و pepcalc حاصل آن بدین‌گونه ترکیب سازه ایمنی‌زای مورد بررسی دارای شاخص ناپایداری 33.93 بود که عددی زیر چهل است که حاکی از آن است که ترکیبی پایدار است و نیمه عمری حدود سی ساعت در بدن پستانداران دارد که این فرصت آن را در بدن ایجاد می‌کند که ایمنی مطلوب‌تری شکل بگیرد.
همچنین وزن مولکولی و PH ایزوالکتریک آن به ترتیب 40884.70 و 9.68 بود که بیانگر شرایط مطلوب سازه ایمنی‌زا هستند. این ترکیب ایمنی‌زا دارای ضریب گراویتی و الیفاتیکی به ترتیب 0.366- و 90.48 بود و حلالیت آن در بدن مناسب تشخیص داده شد. همچنین ضریب خاموشی آن در آب و در طول موج 280 نانومتر 35090 بود و مناسب برای ورود به فاز آزمایشگاهی تشخیص داده شد [21, 22].
با توجه به ساختار دوم ترکیب سازه ایمنی‌زا از نظر درصد آلفا هلیکس با 43.21 درصد بود. درصد بالای آلفا هلیکس در فرایندهای کلونینگ، بعداً اگر محققی بخواهد کارهای کلونینگ کند، مشکل‌ساز می‌شود و نیز درصد نسبتاً پایین آلفا هلیکس‌ها خاصیت تجمعی‌تر این سازه را توضیح می‌دهد.
در مورد ساختار سوم با کمک سرور SWISSMODEL یک مدل مشخص برای کایمر پیشگویی کرد که به منظور ارزیابی کیفیت مدل مورد نظر از نقشــه راماچاندران استفاده شــد. زوایای چرخش phi و psi برای همه باقی‌مانده‌های ساختار پروتئین در محورهای X و Y قابل مشــاهده اســت. زاویه phi چرخش را حول باند N اســیدآمینه نشــان می‌دهد، در حالی که زاویــه psi چرخش راحول باند Calpha-C مشــخص می‌کند.
از آنجا که پلی‌پپتیدها فرایند تاخوردگی را متحمل می‌شوند، زوایای phi و psi در محدوده چرخش 180- تا 180+ درجه بســته به نوع زنجیره جانبی اســید آمینه قرار می‌گیرند. ترکیباتی که اتم‌ها در آن در فاصله‌ای نزدیک‌تر از مجموع شــعاع واندروالسی آنها قرار می‌گیرند، نواحی غیرمجاز یا پرت نقشه را می‌سازند. قرارگیــری در ایــن نواحی برای همه اســید آمینه‌ها به غیر از گلایســین از نظر برخورد فضایی ممکن نیســت. گلایســین به علت نداشتن زنجیره جانبی محدودیت ســایر اســید آمینه‌ها را نداشــته و در تمام نقاط نقشه، به‌خصوص نواحی مخصوص دورها در ساختار دوم که برای سایرین ممنوع اســت، می‌تواند قرار بگیرد.
مکان این اســید آمینه در نقشه حاصل از سرور PROCHECK با علامت مثلث قابل تشخیص است و در محاسبات آماری لحاظ نمی‌شــود. درصــد باقی‌مانده‌ها در ناحیه مطلوب راهنمای خوبی برای ارزیابی کیفیت استریوشیمیایی ساختار است. از طریق بررسی نمودار راماچاندران مشاهده شد که حدود 93.7 درصد از آمینواسیدهای ترکیب مدل واکسن مورد مطالعه در مناطق مطلوب و 5.9 درصد در مناطق مجاز و 0.4 درصد در مناطق تقریباً مجاز و صفر درصد در مناطق غیرمجاز سازه ایمنی‌زا قرار داشت [20].
همچنین با کمک سرور ProSA تمام اتم‌های کربن آلفا سازه ایمنی‌زا بررسی شدند و نتایج حاصل از آن در قالب Z score که 5.65- بود، به دست آمد که عددی مطلوب برای سازه ایمنی‌زا محسوب می‌شود. مقدار درصد جایگاه امینواسیدها در ســرور PROCHECK بالای 90 درصد، برای یک ساختار پایدار با بررســی کریستالوگرافی ساختارهای پروتئینی شناخته شده، مورد انتظار است.
توانایی تشــخیص اپیتوپها در پاســخ ایمنــی، کاربرد مهمی در تشــخیص بیمــاری دارد و در‌نتیجــه از گام‌های اساســی در مطالعات ایمونوبیوانفورماتیک شناســایی و نقشــه‌برداری آنها محســوب می‌شود. اپیتوپها، گروه‌های تعریف‌شده‌ای از اسیدهای آمینه هستند که در ترکیب یک پروتئین قرار دارند و پاسخ ایمنی را به وسیله برهمکنش بــا گیرنده‌های یاخته T و B فعال می‌کنند.
در اینجا، ما توسعه واکسن مبتنی بر اپی‌توپ را بررسی کردیم که پروتئین اسپایک را هدف قرار می‌دهد و از پروتئین اسپایک سلول‌های اپی‌توپی پروتئینی مبتنی بر سلول‌های T که شاید پاسخ ایمنی را در میزبان ترویج دهند، با استفاده از سرورهای Propred-I و MHC2pred بررسی و شناسایی شدند. تجزیه و تحلیل‌ها در سطح ساختاری پروتئین اولیه، ثانویه و سوم روی آنها انجام شد که اپی‌توپ‌های کلاس MHC-I (VGYLQPRTFLLKYNE و YVGYLQPRTFLLKYN و GINITRFQTLLALHR) و در کلاس MHC-II (YVGYLQPRTFLLKYN و GINITRFQTLLALHR و LNRALTGIAVEQDKN) با آلل‌های بیشتری از HLA در تعامل بودن و از نظر طبیعت بسیار آنتی‌ژن‌تر هستند [40].
اپی‌توپ‌های محافظت‌شده سلول‌های B توسط سرور IEDB تجزیه و تحلیل و پیش‌بینی شدند. از ابزارهای دیگر در IEDB برای تحلیل آنتی‌ژنی، انعطاف‌پذیری، دسترسی به حلال و پیوندهای دی سولفید استفاده شد که نواحی 7 تا20، 65 تا 75 و 90 تا 110 سازه ایمنی‌زا مورد بررسی نمره ایمنی بالاتری به نسبت به دیگر بخش‌های آن به دست آورد و این نواحی می‌توانند نماینده بالقوه احتمالی بهتری در سلول‌های B برای نامزد برای تولید واکسن باشند. از سرور دیسکوپ برای پیش‌بینی اپی‌توپ‌های ناپیوسته استفاده شد.
رویکرد اطلاعاتی ایمنی می‌تواند اپی‌توپ‌های بسیار محافظت‌‌شده‌ای را شناسایی کند که ممکن است محافظت گسترده‌ای در برابر سویه‌های مختلف داشته باشد. بر اساس نمره ایمنی و حفظ توالی مشخص است که پپتیدهای محافظت‌شده احتمالاً ایمن هستند.
علاوه بر این، ساختارهای سه‌بُعدی از هر پپتیدهای اتصال‌دهنده کلاس MHC از طریق داکینگ پیش‌بینی برهمکنش آلل HLA-A0201 انسانی با کلاس MHCI و آلل HLA-DRB1-0101 انسانی با کلاس MHCII انجام شد. بر اساس نتایج داکینگ، پتانسیل اتصال و نمره ایمنی، پپتیدهای شناسایی‌شده، شاید در مطالعه حاضر در قیاس با برخی پپتیدهایی که در مطالعات دیگر بررسی شده بودند، ایمنی مطلوب‌تری داشته باشند [41, 42 ,39].
اپی‌توپ‌های پیش‌بینی‌شده باید در مطالعات بعدی برای قدرت درمانی آزمایش شوند. پیش‌بینی می‌کنیم که اپی‌توپ‌های مورد بررسی دارای پتانسیل درمانی با دامنه مطلوبی باشند. تجزیه و تحلیل انفورماتیک ایمنی ما اپی‌توپ‌های T و سلول‌های B راهکاری جدید و با پشتوانه قوی بر اساس الگوریتم‌های محاسباتی است که این ممکن است به توسعه واکسن‌های مبتنی بر پپتیدهای قوی برای پرداختن به چالش قریب‌الوقوع کوید-19 کمک کند.
توسعه واکسن‌های جدید و به موقع برای دفاع از بار جهانی در حال افزایش بیماری‌ها، بسیار مهم است. با پیشرفت فناوری مبتنی بر توالی‌یابی، اکنون اطلاعات کافی در مورد ژنومیک و پروتئومیک ویروس‌های مختلف وجود دارد. درنتیجه، امروزه با کمک ابزارهای مختلف بیوانفورماتیک می‌توان واکسن‌های پپتیدی را بر اساس اپی‌توپ مختلف طراحی کرد.
در پژوهش‌های مختلف طراحی واکسن مبتنی بر اپی‌توپ علیه ویروس‌هایی مانند ویروس تب دنگو، ویروس چیکونگونیا، ویروس آنسفالیت سنت لوئیس و موارد دیگر صورت گرفته است [28, 29 ,30 ,31]. اگرچه طراحی واکسن مبتنی بر اپی‌توپ تبدیل به یک مفهوم آشنا شده است، اما در مورد HCoV هنوز کار زیادی انجام نشده است. HCoV یک ویروس دارای RNA است که به خاطر فقدان سیستم ترمیم بیشتر از ویروس‌های دارای DNA جهش می‌یابد و این نوع جهش‌ها بیشتر در پروتئین غشای خارجی، یعنی پروتئین سنبله یا اسپایک رخ می‌دهد.
این نوع جهش‌ها منجر به فرار آنها از پاسخ‌های ایمنی سلولی و هومورال و باعث افزایش پایداری HCoVها در بدن میزبان می‌شوند [32, 33, 34]. به همین دلیل پروتئین سنبله یا اسپایک به دلیل توانایی در ایجاد پاسخ ایمنی مخاطی سریع‌تر و طولانی‌مدت‌تر نسبت به سایر پروتئین‌ها، بیشترین پتانسیل را به‌عنوان هدف برای طراحی واکسن‌ها دارد. به همین دلیل، محبوبیت زیادی در بین محققان به دست آورده است [35, 36]. از این نظر، باید یک واکسن مناسب HCoV طراحی شود تا بر عوارض جانبی این عفونت ویروسی غلبه کند [37].
در حال حاضر، واکسن‌ها بیشتر مبتنی بر مصونیت سلول B است، اما اخیراً واکسن‌های مبتنی بر اپی‌توپ سلول T ایجاد شده است، زیرا میزبان می‌تواند پاسخ ایمنی قوی سلول CD8+T را علیه سلول آلوده تولید کند. با گذشت زمان، به دلیل رانش آنتی‌ژن، هر ذره خارجی می‌تواند از سلول‌های خاطره ایمنی آنتی‌بادی فرار کند.
با این حال، پاسخ ایمنی سلول T اغلب ایمنی طولانی‌مدتی فراهم می‌کند. در اینجا، اپی‌توپ‌های سلول B و سلول‌های T را برای بررسی پیش‌بینی مصونیت به روش‌های مختلف استفاده کردیم، اما سایر مطالعات اخیر در مورد HCoV فقط نشان‌دهنده اپی‌توپ سلول T است و ما می‌خواهیم یافته‌های بیشتر خود را در اینجا بیان کنیم.
معیارهایی مختلفی وجود دارد که باید توسط یک اپی‌توپ داوطلب واکسن برآورده شود. با این حال، آلرژی‌زایی یکی از موانع برجسته در تولید واکسن است. امروزه، بیشتر واکسن‌ها سیستم ایمنی بدن را به یک واکنش «آلرژیک»، از طریق القای سلول‌های T کمک‌کننده (Th2) و ایمونوگلوبولین E (IgE) تحریک می‌کنند. طبق ارزیابی برنامه سازمان غذا و کشاورزی و سازمان بهداشت جهانی از پیش‌بینی آلرژی‌زایی، یک توالی به طور بالقوه اگر هویت حداقل شش اسید آمینه متعارف یا 0.35 آلرژی‌زا داشته باشد، حساسیت‌زا است.
از این رو، اپی‌توپ‌های مورد بررسی ما معیارهای ارزیابی سازمان غذا و کشاورزی و سازمان بهداشت جهانی از پیش‌بینی آلرژی را برآورده نمی‌کند و توسط این طرح به‌عنوان یک غیر‌آلرژن طبقه‌بندی می‌شود [40] و به همین دلیل، پیشنهاد کردیم که اپی‌توپ پیشنهادی بتواند پاسخ ایمنی مؤثر را به‌عنوان واکسن پپتید در داخل بدن ایجاد کند.
مطالعه ما نشان داده است رویکردهای محاسباتی یکپارچه می‌تواند برای پیش‌بینی کاندیداهای سازه‌های ایمنی‌زا (واکسن)علیه پاتوژن‌ها، ازجمله HCoV با روش‌های معتبر که قبلاً توصیف شده، مورد استفاده قرار گیرد. به این ترتیب، در مطالعات اینسیلیکو هم در زمان و هم هزینه برای محققان صرفه‌جویی می‌شود و می‌تواند کار آزمایشی را با احتمال بیشتری برای پیدا کردن راه‌حل‌های مورد نظر و با آزمایش‌های کمتری و تکرار خطاها از سنجش‌ها هدایت کند.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
تمامی اصول اخلاقی در این مقاله در نظر گرفته شده است. شرکت کنندگان در جریان هدف تحقیق و مراحل اجرای آن قرار گرفتند. آنها از محرمانه بودن اطلاعات خود اطمینان داشتند.اصول کنوانسیون هلسینکی نیز رعایت شد.
حامی مالی
این تحقیق هیچ کمک مالی از سازمان های مالی در بخش های عمومی، تجاری یا غیر انتفاعی دریافت نکرد و یک طرح شخصی می‌باشد.
مشارکت نویسندگان
همه نویسندگان استانداردهای نگارش استاندارد را بر اساس توصیه های کمیته بین المللی ناشران مجلات پزشکی رعایت کردند.
تعارض منافع
هیچ‌گونه تعارض منافعی در نگارش این مقاله وجود ندارد.
تشکر و قدردانی
از اساتید دانشکده دامپزشکی دانشگاه شهید چمران اهواز که همکاری لازم را برای تهیه این کار تحقیقاتی داشتند، تقدیر و تشکر می‌شود.
References
1.González JM, Gomez-Puertas P, Cavanagh D, Gorbalenya AE, Enjuanes L. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae. Arch Virol. 2003; 148(11):2207-35. [DOI:10.1007/s00705-003-0162-1] [PMID] [PMCID]
2.Cavanagh D, Mawditt K, Welchman Dde B, Britton P, Gough RE. Coronaviruses from pheasants (Phasianus colchicus) are genetically closely related to coronaviruses of domestic fowl (infectious bronchitis virus) and turkeys. Avian Pathol. 2002; 31(1):81-93. [DOI:10.1080/03079450120106651] [PMID]
3.Yoo D, Deregt D. A single amino acid change within antigenic domain II of the spike protein of bovine Coronavirus confers resistance to virus neutralization. Clin Diagn Lab Immunol. 2001; 8(2):297-302. [DOI:10.1128/CDLI.8.2.297-302.2001] [PMID] [PMCID]
4.Bourdette DN, Edmonds E, Smith C, Bowen JD, Guttmann CR, Nagy ZP, et al. A highly immunogenic trivalent T cell receptor peptide vaccine for multiple sclerosis. Mult Scler. 2005; 11(5):552-61. [DOI:10.1191/1352458505ms1225oa] [PMID]
5.López JA, Weilenman C, Audran R, Roggero MA, Bonelo A, Tiercy JM, et al. A synthetic malaria vaccine elicits a potent CD8(+) and CD4(+) T lymphocyte immune response in humans. Implications for vaccination strategies. Eur J Immunol. 2001; 31(7):1989-98. [DOI:10.1002/1521-4141(200107)31:73.0.CO;2-M]
6.Knutson KL, Schiffman K, Disis ML. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER-2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J Clin Invest. 2001; 107(4):477-84. [DOI:10.1172/JCI11752] [PMID] [PMCID]
7.Petrovsky N, Brusic V. Computational immunology: The coming of age. Immunol Cell Biol. 2002; 80(3):248-54. [DOI:10.1046/j.1440-1711.2002.01093.x] [PMID]
8.Doytchinova IA, Flower DR. VaxiJen: A server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinformatics. 2007; 8:4. [DOI:10.1186/1471-2105-8-4] [PMID] [PMCID]
9.Liao L, Noble WS. Combining pairwise sequence similarity and support vector machines for detecting remote protein evolutionary and structural relationships. J Comput Biol. 2003; 10(6):857-68. [DOI:10.1089/106652703322756113] [PMID]
10.Kolaskar AS, Tongaonkar PC. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett. 1990; 276(1-2):172-4. [DOI:10.1016/0014-5793(90)80535-Q]
11.Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol. 1985; 55(3):836-9. [DOI:10.1128/jvi.55.3.836-839.1985] [PMID] [PMCID]
12.Karplus PA, Schulz GE. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften. 1985; 72(4):212-3. [DOI:10.1007/BF01195768]
13.Larsen JE, Lund O, Nielsen M. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res. 2006; 2:2. [DOI:10.1186/1745-7580-2-2] [PMID] [PMCID]
14.Chou PY, Fasman GD. Empirical predictions of protein conformation. Annu Rev Biochem. 1978; 47:251-76. [DOI:10.1146/annurev.bi.47.070178.001343] [PMID]
15.Dimitrov I, Bangov I, Flower DR, Doytchinova I. AllerTOP v. 2—a server for in silico prediction of allergens. Journal of Molecular Modeling. 2014; 20(6):1-6. [DOI:10.1007/s00894-014-2278-5]
16.Dimitrov I, Naneva L, Doytchinova I, Bangov I. AllergenFP: Allergenicity prediction by descriptor fingerprints. Bioinformatics. 2014; 30(6):846-51. [DOI:10.1093/bioinformatics/btt619]
17.Gupta S, Kapoor P, Chaudhary K, Gautam A, Kumar R, Open Source Drug Discovery Consortium, Raghava GP. In silico approach for predicting toxicity of peptides and proteins. PloS One. 2013; 8(9):e73957. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0073957
18.Thévenet P, Shen Y, Maupetit J, Guyon F, Derreumaux P, Tuffery P. PEP-FOLD: An updated de novo structure prediction server for both linear and disulfide bonded cyclic peptides. Nucleic Acids Res. 2012; 40(W1):W288-93. [DOI:10.1093/nar/gks419] [PMID] [PMCID]
19.Shen Y, Maupetit J, Derreumaux P, Tufféry P. Improved PEP-FOLD approach for peptide and miniprotein structure prediction. J Chem Theory Comput. 2014; 10(10):4745-58. [DOI:10.1021/ct500592m] [PMID]
20.Zhang Y, Skolnick J. Scoring function for automated assessment of protein structure template quality. Proteins. 2004; 57(4):702-10. [DOI:10.1002/prot.20264]
21.Ali M, Pandey RK, Khatoon N, Narula A, Mishra A, Prajapati VK. Exploring dengue genome to construct a multi-epitope based subunit vaccine by utilizing immunoinformatics approach to battle against dengue infection. Sci Rep. 2017; 7(1):9232. [DOI:10.1038/s41598-017-09199-w] [PMID] [PMCID]
22.Ikai A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins. J Biochem. 1980; 88(6):1895-8. [PMID]
23.Rose GD, Gierasch L, Smith JA. Turns in peptides and proteins. Adv Protein Chem. 1985; 37:1-109. [DOI:10.1016/S0065-3233(08)60063-7]
24.Larsen MV, Lundegaard C, Lamberth K, Buus S, Lund O, Nielsen M. Large-scale validation of methods for cytotoxic T-lymphocyte epitope prediction. BMC Bioinformatics. 2007; 8:424. [DOI:10.1186/1471-2105-8-424] [PMID] [PMCID]
25.Zhang M, Ishii K, Hisaeda H, Murata S, Chiba T, Tanaka K, et al. Ubiquitin-fusion degradation pathway plays an indispensable role in naked DNA vaccination with a chimeric gene encoding a syngeneic cytotoxic T lymphocyte epitope of melanocyte and green fluorescent protein. Immunology. 2004; 112(4):567-74. [DOI:10.1111/j.1365-2567.2004.01916.x] [PMID] [PMCID]
26.Yang X, Yu X. An introduction to epitope prediction methods and software. Rev Med Virol. 2009; 19(2):77-96. [DOI:10.1002/rmv.602] [PMID]
27.Singh H, Raghava G. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 2001; 17(12):1236-7. [DOI:10.1093/bioinformatics/17.12.1236] [PMID]
28.Lapelosa M, Gallicchio E, Arnold GF, Arnold E, Levy RM. In silico vaccine design based on molecular simulations of rhinovirus chimeras presenting HIV-1 gp41 epitopes. J Mol Biol. 2009; 385(2):675-91. [DOI:10.1016/j.jmb.2008.10.089] [PMID] [PMCID]
29.Chakraborty S, Chakravorty R, Ahmed M, Rahman A, Waise TM, Hassan F, et al. A computational approach for identification of epitopes in dengue virus envelope protein: A step towards designing a universal dengue vaccine targeting endemic regions. In Silico Biol. 2010; 10(5-6):235-46. [DOI:10.3233/ISB-2010-0435] [PMID]
30.Islam R, Sakib MS, Zaman A. A computational assay to design an epitope-based peptide vaccine against chikungunya virus. Future Virol. 2012; 7(10):1029-42. [DOI:10.2217/fvl.12.95]
31.Hasan MA, Hossain M, Alam MJ. A computational assay to design an epitope-based Peptide vaccine against Saint Louis encephalitis virus. Bioinform Biol Insights. 2013; 7:347-55. [DOI:10.4137/BBI.S13402] [PMID] [PMCID]
32.Twiddy SS, Holmes EC, Rambaut A. Inferring the rate and time-scale of dengue virus evolution. Mol Biol Evol. 2003; 20(1):122-9. [DOI:10.1093/molbev/msg010] [PMID]
33.Manzin A, Solforosi L, Petrelli E, Macarri G, Tosone G, Piazza M, et al. Evolution of hypervariable region 1 of hepatitis C virus in primary infection. J Virol. 1998; 72(7):6271-6. [DOI:10.1128/JVI.72.7.6271-6276.1998] [PMID] [PMCID]
34.Christie JM, Chapel H, Chapman RW, Rosenberg WM. Immune selection and genetic sequence variation in core and envelope regions of hepatitis C virus. Hepatology. 1999; 30(4):1037-44. [DOI:10.1002/hep.510300403] [PMID]
35.Ma C, Li Y, Wang L, Zhao G, Tao X, Tseng CT, et al. Intranasal vaccination with recombinant receptor-binding domain of MERS-CoV spike protein induces much stronger local mucosal immune responses than subcutaneous immunization: Implication for designing novel mucosal MERS vaccines. Vaccine. 2014; 32(18):2100-8. [DOI:10.1016/j.vaccine.2014.02.004] [PMID] [PMCID]
36.Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, et al. A DNA vaccine induces SARS Coronavirus neutralization and protective immunity in mice. Nature. 2004; 428(6982):561-4. [DOI:10.1038/nature02463] [PMID] [PMCID]
37.Sudhakar A, Robin G, Boyd L, Agnihothram S, Gopal R, Yount BL, et al. Platform strategies for rapid response against emerging coronaviruses: MERS-CoV serologic and antigenic relationships in vaccine design. The Journal of Infectious Diseases. 2013; 10:1093.
38.McKeever TM, Lewis SA, Smith C, Hubbard R. Vaccination and allergic disease: A birth cohort study. Am J Public Health. 2004; 94(6):985-9. [DOI:10.2105/AJPH.94.6.985] [PMID] [PMCID]
39.Zhou Y, Yang Y, Huang J, Jiang S, Du L. Advances in MERS-CoV vaccines and therapeutics based on the receptor-binding domain. Viruses. 2019; 11(1):60. [DOI:10.3390/v11010060] [PMID] [PMCID]
40.Li Y-H, Gao H, Xiao Y, Weng T, Yu D, Hu C, et al. Bioinformatics analysis on potential anti-viral targets against spike protein of MERS-CoV. 9th international conference on information technology in medicine and education (ITME), 2018 Oct 19-21, Hangzhou, China. [DOI:10.1109/ITME.2018.00026]
41.Mubarak A, Alturaiki W, Hemida MG. Middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV): Infection, immunological response, and vaccine development. J Immunol Res. 2019; 2019:6491738. [DOI:10.1155/2019/6491738.. https://www.hindawi.com/journals/jir/2019/6491738/] [PMID] [PMCID]
42.Shi J, Zhang J, Li S, Sun J, Teng Y, Wu M, et al. Epitope-based vaccine target screening against highly pathogenic MERS-CoV: An in silico approach applied to emerging infectious diseases. PLoS ONE. 2015; 10:e0144475. [DOI:10.1371/journal.pone.0144475] [PMID] [PMCID]
1.González JM, Gomez-Puertas P, Cavanagh D, Gorbalenya AE, Enjuanes L. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae. Arch Virol. 2003; 148(11):2207-35. [DOI:10.1007/s00705-003-0162-1] [PMID] [PMCID]
2.Cavanagh D, Mawditt K, Welchman Dde B, Britton P, Gough RE. Coronaviruses from pheasants (Phasianus colchicus) are genetically closely related to coronaviruses of domestic fowl (infectious bronchitis virus) and turkeys. Avian Pathol. 2002; 31(1):81-93. [DOI:10.1080/03079450120106651] [PMID]
3.Yoo D, Deregt D. A single amino acid change within antigenic domain II of the spike protein of bovine Coronavirus confers resistance to virus neutralization. Clin Diagn Lab Immunol. 2001; 8(2):297-302. [DOI:10.1128/CDLI.8.2.297-302.2001] [PMID] [PMCID]
4.Bourdette DN, Edmonds E, Smith C, Bowen JD, Guttmann CR, Nagy ZP, et al. A highly immunogenic trivalent T cell receptor peptide vaccine for multiple sclerosis. Mult Scler. 2005; 11(5):552-61. [DOI:10.1191/1352458505ms1225oa] [PMID]
5.López JA, Weilenman C, Audran R, Roggero MA, Bonelo A, Tiercy JM, et al. A synthetic malaria vaccine elicits a potent CD8(+) and CD4(+) T lymphocyte immune response in humans. Implications for vaccination strategies. Eur J Immunol. 2001; 31(7):1989-98. [DOI:10.1002/1521-4141(200107)31:73.0.CO;2-M]
6.Knutson KL, Schiffman K, Disis ML. Immunization with a HER-2/neu helper peptide vaccine generates HER-2/neu CD8 T-cell immunity in cancer patients. J Clin Invest. 2001; 107(4):477-84. [DOI:10.1172/JCI11752] [PMID] [PMCID]
7.Petrovsky N, Brusic V. Computational immunology: The coming of age. Immunol Cell Biol. 2002; 80(3):248-54. [DOI:10.1046/j.1440-1711.2002.01093.x] [PMID]
8.Doytchinova IA, Flower DR. VaxiJen: A server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC Bioinformatics. 2007; 8:4. [DOI:10.1186/1471-2105-8-4] [PMID] [PMCID]
9.Liao L, Noble WS. Combining pairwise sequence similarity and support vector machines for detecting remote protein evolutionary and structural relationships. J Comput Biol. 2003; 10(6):857-68. [DOI:10.1089/106652703322756113] [PMID]
10.Kolaskar AS, Tongaonkar PC. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens. FEBS Lett. 1990; 276(1-2):172-4. [DOI:10.1016/0014-5793(90)80535-Q]
11.Emini EA, Hughes JV, Perlow DS, Boger J. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. J Virol. 1985; 55(3):836-9. [DOI:10.1128/jvi.55.3.836-839.1985] [PMID] [PMCID]
12.Karplus PA, Schulz GE. Prediction of chain flexibility in proteins. Naturwissenschaften. 1985; 72(4):212-3. [DOI:10.1007/BF01195768]
13.Larsen JE, Lund O, Nielsen M. Improved method for predicting linear B-cell epitopes. Immunome Res. 2006; 2:2. [DOI:10.1186/1745-7580-2-2] [PMID] [PMCID]
14.Chou PY, Fasman GD. Empirical predictions of protein conformation. Annu Rev Biochem. 1978; 47:251-76. [DOI:10.1146/annurev.bi.47.070178.001343] [PMID]
15.Dimitrov I, Bangov I, Flower DR, Doytchinova I. AllerTOP v. 2—a server for in silico prediction of allergens. Journal of Molecular Modeling. 2014; 20(6):1-6. [DOI:10.1007/s00894-014-2278-5]
16.Dimitrov I, Naneva L, Doytchinova I, Bangov I. AllergenFP: Allergenicity prediction by descriptor fingerprints. Bioinformatics. 2014; 30(6):846-51. [DOI:10.1093/bioinformatics/btt619]
17.Gupta S, Kapoor P, Chaudhary K, Gautam A, Kumar R, Open Source Drug Discovery Consortium, Raghava GP. In silico approach for predicting toxicity of peptides and proteins. PloS One. 2013; 8(9):e73957. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0073957
18.Thévenet P, Shen Y, Maupetit J, Guyon F, Derreumaux P, Tuffery P. PEP-FOLD: An updated de novo structure prediction server for both linear and disulfide bonded cyclic peptides. Nucleic Acids Res. 2012; 40(W1):W288-93. [DOI:10.1093/nar/gks419] [PMID] [PMCID]
19.Shen Y, Maupetit J, Derreumaux P, Tufféry P. Improved PEP-FOLD approach for peptide and miniprotein structure prediction. J Chem Theory Comput. 2014; 10(10):4745-58. [DOI:10.1021/ct500592m] [PMID]
20.Zhang Y, Skolnick J. Scoring function for automated assessment of protein structure template quality. Proteins. 2004; 57(4):702-10. [DOI:10.1002/prot.20264]
21.Ali M, Pandey RK, Khatoon N, Narula A, Mishra A, Prajapati VK. Exploring dengue genome to construct a multi-epitope based subunit vaccine by utilizing immunoinformatics approach to battle against dengue infection. Sci Rep. 2017; 7(1):9232. [DOI:10.1038/s41598-017-09199-w] [PMID] [PMCID]
22.Ikai A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins. J Biochem. 1980; 88(6):1895-8. [PMID]
23.Rose GD, Gierasch L, Smith JA. Turns in peptides and proteins. Adv Protein Chem. 1985; 37:1-109. [DOI:10.1016/S0065-3233(08)60063-7]
24.Larsen MV, Lundegaard C, Lamberth K, Buus S, Lund O, Nielsen M. Large-scale validation of methods for cytotoxic T-lymphocyte epitope prediction. BMC Bioinformatics. 2007; 8:424. [DOI:10.1186/1471-2105-8-424] [PMID] [PMCID]
25.Zhang M, Ishii K, Hisaeda H, Murata S, Chiba T, Tanaka K, et al. Ubiquitin-fusion degradation pathway plays an indispensable role in naked DNA vaccination with a chimeric gene encoding a syngeneic cytotoxic T lymphocyte epitope of melanocyte and green fluorescent protein. Immunology. 2004; 112(4):567-74. [DOI:10.1111/j.1365-2567.2004.01916.x] [PMID] [PMCID]
26.Yang X, Yu X. An introduction to epitope prediction methods and software. Rev Med Virol. 2009; 19(2):77-96. [DOI:10.1002/rmv.602] [PMID]
27.Singh H, Raghava G. ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 2001; 17(12):1236-7. [DOI:10.1093/bioinformatics/17.12.1236] [PMID]
28.Lapelosa M, Gallicchio E, Arnold GF, Arnold E, Levy RM. In silico vaccine design based on molecular simulations of rhinovirus chimeras presenting HIV-1 gp41 epitopes. J Mol Biol. 2009; 385(2):675-91. [DOI:10.1016/j.jmb.2008.10.089] [PMID] [PMCID]
29.Chakraborty S, Chakravorty R, Ahmed M, Rahman A, Waise TM, Hassan F, et al. A computational approach for identification of epitopes in dengue virus envelope protein: A step towards designing a universal dengue vaccine targeting endemic regions. In Silico Biol. 2010; 10(5-6):235-46. [DOI:10.3233/ISB-2010-0435] [PMID]
30.Islam R, Sakib MS, Zaman A. A computational assay to design an epitope-based peptide vaccine against chikungunya virus. Future Virol. 2012; 7(10):1029-42. [DOI:10.2217/fvl.12.95]
31.Hasan MA, Hossain M, Alam MJ. A computational assay to design an epitope-based Peptide vaccine against Saint Louis encephalitis virus. Bioinform Biol Insights. 2013; 7:347-55. [DOI:10.4137/BBI.S13402] [PMID] [PMCID]
32.Twiddy SS, Holmes EC, Rambaut A. Inferring the rate and time-scale of dengue virus evolution. Mol Biol Evol. 2003; 20(1):122-9. [DOI:10.1093/molbev/msg010] [PMID]
33.Manzin A, Solforosi L, Petrelli E, Macarri G, Tosone G, Piazza M, et al. Evolution of hypervariable region 1 of hepatitis C virus in primary infection. J Virol. 1998; 72(7):6271-6. [DOI:10.1128/JVI.72.7.6271-6276.1998] [PMID] [PMCID]
34.Christie JM, Chapel H, Chapman RW, Rosenberg WM. Immune selection and genetic sequence variation in core and envelope regions of hepatitis C virus. Hepatology. 1999; 30(4):1037-44. [DOI:10.1002/hep.510300403] [PMID]
35.Ma C, Li Y, Wang L, Zhao G, Tao X, Tseng CT, et al. Intranasal vaccination with recombinant receptor-binding domain of MERS-CoV spike protein induces much stronger local mucosal immune responses than subcutaneous immunization: Implication for designing novel mucosal MERS vaccines. Vaccine. 2014; 32(18):2100-8. [DOI:10.1016/j.vaccine.2014.02.004] [PMID] [PMCID]
36.Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, et al. A DNA vaccine induces SARS Coronavirus neutralization and protective immunity in mice. Nature. 2004; 428(6982):561-4. [DOI:10.1038/nature02463] [PMID] [PMCID]
37.Sudhakar A, Robin G, Boyd L, Agnihothram S, Gopal R, Yount BL, et al. Platform strategies for rapid response against emerging coronaviruses: MERS-CoV serologic and antigenic relationships in vaccine design. The Journal of Infectious Diseases. 2013; 10:1093.
38.McKeever TM, Lewis SA, Smith C, Hubbard R. Vaccination and allergic disease: A birth cohort study. Am J Public Health. 2004; 94(6):985-9. [DOI:10.2105/AJPH.94.6.985] [PMID] [PMCID]
39.Zhou Y, Yang Y, Huang J, Jiang S, Du L. Advances in MERS-CoV vaccines and therapeutics based on the receptor-binding domain. Viruses. 2019; 11(1):60. [DOI:10.3390/v11010060] [PMID] [PMCID]
40.Li Y-H, Gao H, Xiao Y, Weng T, Yu D, Hu C, et al. Bioinformatics analysis on potential anti-viral targets against spike protein of MERS-CoV. 9th international conference on information technology in medicine and education (ITME), 2018 Oct 19-21, Hangzhou, China. [DOI:10.1109/ITME.2018.00026]
41.Mubarak A, Alturaiki W, Hemida MG. Middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV): Infection, immunological response, and vaccine development. J Immunol Res. 2019; 2019:6491738. [DOI:10.1155/2019/6491738.. https://www.hindawi.com/journals/jir/2019/6491738/] [PMID] [PMCID]
42.Shi J, Zhang J, Li S, Sun J, Teng Y, Wu M, et al. Epitope-based vaccine target screening against highly pathogenic MERS-CoV: An in silico approach applied to emerging infectious diseases. PLoS ONE. 2015; 10:e0144475. [DOI:10.1371/journal.pone.0144475] [PMID] [PMCID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
