مقدمه
سرطان کلورکتال سومین سرطان کشنده در جهان است. این سرطان پایین‌ترین قسمت دستگاه گوارش (کولون و رکتال) را درگیر می‌کند [1]. سلول‌های سرطانی در شرایط متنوع محیطی، قدرت بقا و تکثیر متفاوتی دارند که نتیجه جهش‌های پی‌در‌پی ایجادشده در سلول سرطانی است [2]. شکل‌گیری تومور علاوه بر تغییرات ژنتیک به تغییرات اپی ژنتیک هم مربوط می‌شود. یکی از مسیرهای اپی ژنتیک، استیلاسیون هیستون‌ها هستند. سطح استیلاسیون بر فعالیت رونویسی تأثیر می‌گذارد. استیلاسیون موجب باز شدن کروماتین می‌شود و اجازه دسترسی مکانیسم رونویسی به اپراتور را می‌دهد. استیلاسیون کروماتین موجب فعال شدن رونویسی می‌شود [4 ،3].
هیستون داستیلازها شامل گروهی از آنزیم‌ها هستند که مسئول حذف گروه‌های استیل از اسیدآمینه لیزین‌اند. تغییرات آنزیم هیستون داستیلاز در بسیاری از سرطان‌ها از جمله سرطان کولورکتال دیده شده است، بنابراین داروهای مهارکننده این آنزیم می‌تواند در مهار سرطان نقش داشته باشد. یافتن دارویی با تجویز آسان و IC 50 پایین برای کاهش عوارض جانبی، بسیار مفید و ضروری است. از آنجایی که مهارکننده‌های داستیلاسیون قبلی اثر کوتاه‌مدتی بر سلول‌های سرطانی داشتند، تحقیقات جدید به بررسی داروهایی می‌پردازد که اثر فارماکودینامیک طولانی‌تری بر روی سلول‌های سرطانی بگذارند [5]. داروی کویزینوستات به‌ منزله یک داروی جدید در درمان سرطان کولورکتال و سایر سرطان‌ها از جمله ریه، کولون، پستان، پروستات و تخمدان مطرح است و پتانسیل زیادی در درمان تومورها دارد [6]. این دارو در دوزهای نانومولار با مهار داستیله شدن هیستون‌ها خاصیت انتی نئوپلازی دارد. اکثر داروهای مهارکننده عمومی هیستون داستیلازها هم‌زمان روی چند هیستون داستیلاز تأثیر مهاری داشته و بنابراین عوارض جانبی بیشتری دارند و شاید تأثیر انتخابی که در ارگان هدف مدنظر است را به طور مطلوب نداشته باشند [7]. مشخص شده است که تغییرات اپی ژنتیکی ممکن است یکی از نشانه‌های تشخیص سرطان باشد، زیرا این تغییرات پس از انتقال ممکن است نقش مهمی در پیشرفت سرطان به وسیله مدولاسیون رونویسی ژن، بازسازی کروماتین و معماری هسته داشته باشد. جای تعجب نیست که تغییر در استیلاسیون یا بیان HDAC (خصوصاً کلاس I ,II و IV) با تعدادی از سرطان‌های تومورهای جامد مرتبط است [8]. به همین دلیل استفاده از داروهای مهارکننده استیلاسیون روش مؤثری در جلوگیری از پیشرفت سرطان است. کویزینوستات یک داروی خوراکی با قدرت مهارکنندگی داستیلاسیون هیستونی است که برای جلوگیری از فعالیت آنزیم HDAC1 در تومورهای جامد کاربرد درمانی دارد. در حال حاضر تحقیقات زیادی روی اثر درمانی این دارو به‌ منزله مهارکننده پروتئوزوم برای درمان سارکوم‌های سینوویال (synovial) و مرتبط با جابه‌جایی کروموزومی در حال انجام است. از آنجایی که کوئیزینوستات به ‌منزله مهارکننده HADC می‌تواند با IC 50 کم بالاترین قدرت را در مهار سلول‌های سرطانی داشته باشد، در این پژوهش تأثیر داروی کوئیزینوستات را، که یکی از این مهارکننده‌های اپی ژنیک بر مهاجرت سلول‌های سرطان کولورکتال است، بررسی می‌کنیم. 
مواد و روش‌ها 
سلول‌های اولیه جداشده از بافت سرطانی کولون از بیوبانک مرکز کنترل سلامت رم به صورت هدیه دریافت شد. سلول‌ها در ابتدا کشت داده شد. از آنجایی که داروی کویزینوستات در DMSO حل می‌شود، برای حل شدن دارو، مقدار بی‌خطر محاسبه و در آن حل شد. DMSO یک ترکیب گوگردی است که مسکن طبیعی و ضدالتهاب بوده و علاوه بر اینکه به شکل حلال کاربرد دارد، به طور خاص برای خواص درمانی نیز استفاده می‌شود. به همین دلیل در گروه‌بندی آزمایش یک گروه به بررسی تأثیرات DMSO بر میزان مهاجرت سلولی اختصاص داده شد.
برای بررسی ترکیبات موجود در نیچ که می‌تواند بر مهاجرت و متاستاز سلول اثر بگذارد، از تست مهاجرت سلولی استفاده شد. برای انجام آزمایش سه گروه به ترتیب گروه اول سلول تیمارنشده، گروه دوم سلول تیمارشده با کویزینوستات و گروه سوم سلول تیمارشده با DMSO در نظر گرفته شد. سلول‌ها در محیط کشت 12 DMEM/F همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد پنی‌سیلین / استرپتومایسین در شرایط دمای 37 درجه سانتی‌گراد و CO2 5 درصد کشت داده شدند. پس از رشد اسفروئیدها به کمک جداسازی مکانیکی و یا در صورت لزوم استفاده از تریپسین 0/25 درصد (اینوتیروژن، آمریکا) به صورت سوسپانسیون سلولی درآورده و شمارش شدند. سلول‌ها در پلیت 96 خانه مخصوص تست مهاجرت کشت داده شدند. در این روش چاهک به دو بخش تقسیم می‌شود. سوسپانسیون سلولی به بخش بالایی اضافه شده و سلول‌ها در طول غشا مهاجرت می‌کنند. مهاجرت سلولی با شمارش سلول‌ها در قسمت پایین غشا انجام می‌شود. سلول‌های قسمت پایینی با رنگ فلورسانت رنگ‌آمیزی و با میکروسکوپ مخصوص شمارش می‌شوند. سلول‌ها پس از جداسازی و شمارش، در چاهک‌های بالایی پلیت مخصوص بررسی مهاجرت کشت داده شدند، به طوری که در هر چاهک تعداد 1000 سلول به همراه 50 محیط کشت، قرار داده شد. برای گروه تیمار از دارو با غلظت nM200 و گروه سوم فقط از DMSO استفاده شد. از آنجایی که داروی کوئیزینوستات در DMSO حل می‌شود و با توجه به سمیت DMSO برای سلول‌ها، محاسبه شد که غلظت DMSO در چاهک بیشتر از 0/25 درصد نشود. برای بررسی مهاجرت سلول‌های تیمارشده به چاهک‌های پایینی، در هر چاهک 225 از محیط کشت ریخته شد. این آزمایش در فاصله زمانی 24 ساعت پس از تیمار اندازه‌گیری و سه بار تکرار شد. برای شمارش میزان مهاجرت 24 ساعت پس از تیمار، به کمک میکروسکوپ فلورسانس میزان سلول‌ها در چاهک پایینی شمارش شدند. 
یافته‌ها
قبل از اضافه کردن سوسپانسیون سلولی به قسمت بالایی غشای سلول‌ها به مدت 24 ساعت در محیط کشت بدون FBS نگهداری شدند تا به مرحله گرسنگی برسند. 24 ساعت بعد میزان سلول‌های مهاجرت کرده به چاهک پایینی شمارش شد. لازم به ذکر است که اندازه سوراخ‌های فیلتر چاهک μM 12 با توجه به اندازه سلول انتخاب شدند [9]. نتایج به‌دست‌آمده به‌خوبی نشان داد که کوئیزینوستات داروی بسیار مفید و مؤثری برای جلوگیری از مهاجرت سلول‌های سرطانی است و در درازمدت باعث جلوگیری از متاستاز و گسترش سرطان خواهد شد. همان طور که در تصویر شماره 1 دیده می‌شود، تیمار سلول‌های با کوئیزینوستات nM200 میزان مهاجرت سلولی را 50 درصد کاهش داده است (تصویر شماره 1). 

تمام آزمایش‌ها حداقل سه بار تکرار شد. داده‌ها به کمک آزمون one-way ANOVA تجزیه و تحلیل شدند. در این آزمون مقدار 0/05 یا کمتر معنی‌دار در نظر گرفته شد.
بحث
در این مقاله به بررسی تیمار با HDACi روی رده سلول‌های کولورکتال پرداخته شد. نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که DMSO به‌تنهایی اثر معنی‌داری بر مهاجرت سلول‌ها ندارد. از آنجایی که تیمار با کئوزینوستات میزان مهاجرت را تا 50 درصد کاهش داده است، می‌توان نتیجه گرفت کئوزینوستات به وسیله داستیلاسیون هیستون سبب فشردگی کروماتین و متعاقباً سرکوبی ژن‌های مؤثر در بیان پروتئین‌های لازم برای مهاجرت سلولی شده است [8]. تحقیقات قبلی نیز اثر HDACi بر مسیرهای سلولی تکثیر در سرطان را ارزیابی کرده و مثلاً مشخص کرده بود که HDACi می‌تواند P53 را فعال کند [5]. همچنین برخی تحقیقات نشان داده است که در حضور HDACi حساسیت سلول‌های سرطانی به آپوپتوز زیاد می‌شود [4]. تجویز خوراکی کئوزینوستات باعث استیلاسیون مداوم H3 و مهار پیشرفت تومور در تومورهای روده بزرگ می‌شود [3]. 
انزیم هیستون داستیلاز می‌تواند بر میزان تراکم کروماتین تأثیر بگذارد و از طریق دی استیل کردن باقی‌مانده‌های لیزین، هیستون‌هایی محدودکننده دسترسی به سایت‌های رونویسی، بیان ژن را تنظیم کند. فعالیت نامطلوب این آنزیم در انواع سرطان‌ها دیده شده است. این فعالیت موجب تغییر سلول‌های سرطانی به CSCs شده و زمینه افزایش متاستاز و مهاجرت سلولی را فراهم می‌آورد، چراکه موجب بیان نشدن ژن‌هایی می‌شود که سلول‌های معیوب را به سمت آپوپتوز می‌برد [9، 11]. اعضای خانواده آنزیم‌های داستیله‌کننده نقشی اساسی در ایجاد و پیشرفت سرطان دارا هستند. در سال‌های اخیر با بررسی میزان بروز ژن مولد این آنزیم‌ها در انواع سرطان و اثر داروهای مهارکننده، امکان ایجاد اهداف درمانی و بالاخص دارویی جدید در درمان سرطان‌ها فراهم شده است [4].
بررسی و ترمیم استیلاسیون هیستون‌ها به وسیله مولکول‌هایی که مانع از فعالیت نابه‌جای هیستون‌داستیلازها می‌شود، می‌تواند نقش مهمی در هومئوستازی و عملکرد پروتئین‌های کروماتین بازی کند. این ترمیم ممکن است شروع و پیشرفت سرطان را معکوس کند. این مولکول‌ها با یاند کردن یون روی در محل فعال آنزیم داستیله‌کننده موجب مهار عملکرد آن می‌شود [8]. همچنین در طی مصرف HDACi، به علت حساسیت بیشتر سلول‌های سرطانی به آپوپتوز نسبت به سلول‌های طبیعی، مشخص شده که این دارو در از بین بردن سلول‌های سرطانی نقش مؤثری دارد [8، 12]. نتایج به‌دست‌آمده از این تحقیق نشان داد که کئوزینوستات به ‌منزله یک داروی مهارکننده استیلاسیون هیستون توانسته به‌خوبی مانع مهاجرت سلولی شده و از متاستاز سرطان جلوگیری کند.
نتیجه‌گیری
HDAC نقش بزرگی در پیشرفت سرطان دارند و آشنایی با داروهای مهارکننده این آنزیم کمک فراوانی به درمان سرطان خواهد کرد. این مطالعه نشان داد کویزینوستات نقش مهمی در مهار این آنزیم دارد.

ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این مطالعه حاصل حاصل طرح تحقیق با شماره 96GCU3M1293 از دانشگاه شیراز است که مورد تایید کمیته اخلاق دانشگاه قرار گرفته است.

حامی مالی
این تحقیق هیچ گونه کمک مالی از سازمان‌های تأمین مالی در بخش‌های عمومی ، تجاری یا غیرانتفاعی دریافت نکرد.

مشارکت نویسندگان
 تمام نویسندگان در طراحی، اجرا و نگارش همه بخش‌های پژوهش حاضر مشارکت داشته‌اند.

تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان این مقاله تعارض منافع ندارد.

تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم می‌دانند از مرکز تحقیقات سلامت رم ایتالیا و همکاران محترم در مرکز بیوبانک برای کمک در اجرای این پروژه تشکر و قدردانی کنند.

References
1.Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Jemal A. CA: Global cancer statistics. Am Cancer Soc J. 2012; 65(2):87-108. [DOI:10.3322/caac.21262]
2.Fiori ME, Villanova L, De Maria R. Cancer stem cells: At the forefront of personalized medicine and immunotherapy. Curr Opin Pharmacol. 2017; 35:1-11. [DOI:10.1016/j.coph.2017.04.006]
3.Carol H, Gorlick R, Kolb EA, Morton CL, Moradi Manesh D, Keir ST, et al. Initial testing (stage 1) of the histone deacetylase inhibitor, quisinostat (JNJ-26481585), by the Pediatric Preclinical Testing Program. Pediatr Blood Cancer. 2014; 61(2):245-52. [DOI:10.1002/pbc.24724]
4.Arts J, King P, Mariën A, Floren W, Beliën A, Janssen L, et al. JNJ-26481585, a novel “second-generation” oral histone deacetylase inhibitor, shows broad-spectrum preclinical antitumoral activity. Clin Cancer Res. 2009; 15(22):6841-51. [DOI:10.1158/1078-0432.CCR-09-0547]
5.Bose P, Dai Y, Grant S. Histone deacetylase inhibitor (HDACI) mechanisms of action: Emerging insights. Pharmacol Ther. 2014; 143(3):323-36. [DOI:10.1016/j.pharmthera.2014.04.004]
6.Venugopal B, Baird R, Kristeleit RS, Plummer R, Cowan R, Stewart A, et al. A phase I study of quisinostat (JNJ-26481585), an oral hydroxamate histone deacetylase inhibitor with evidence of target modulation and antitumor activity, in patients with advanced solid tumors. Clin Cancer Res. 2013; 19(15):4262-72. [DOI:10.1158/1078-0432.CCR-13-0312]
7.de Nadal E, Zapater M, Alepuz PM, Sumoy L, Mas G, Posas F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 2004; 427:370-4. [DOI:10.1038/nature02258]
8.Li Y, Seto E. HDACs and HDAC inhibitors in cancer development and therapy. Cold Spring Harb Perspect Med. 2016; 6:a026831. [DOI:10.1101/cshperspect.a026831]
9.Hulkower KI, Herber RL. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharm. 2011; 3(1):107-24.[DOI:10.3390/pharmaceutics3010107]
10.Wainwright EN, Scaffidi P. Epigenetics and cancer stem cells: Unleashing, hijacking, and restricting cellular plasticity. Trends Cancer. 2017; 3(5):372-86. [DOI:10.1016/j.trecan.2017.04.004]
11.Heijkants R, Willekens K, Schoonderwoerd M, Teunisse A, Nieveen M, Radaelli E, et al. Combined inhibition of CDK and HDAC as a promising therapeutic strategy for both cutaneous and uveal metastatic melanoma. Oncotarget. 2018; 9:6174-87. [DOI:10.18632/oncotarget.23485]
12.Guenther MG, Barak OR, Lazar MA. The SMRT and N-CoR corepressors are activating cofactors for histone deacetylase 3. Mol Cell Biol. 2001; 21(18):6091-101. [DOI:10.1128/MCB.21.18.6091-6101.2001]