دوره 25، شماره 1 - ( فروردین و اردیبهشت 1401 )
جلد 25 شماره 1 صفحات 27-14 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Hashemi R, Peymani M, Ghaedi K, Saffar H. Evaluation and Comparison of PBK and E2F7 Gene Expression Between Early and Advanced Stages of Colorectal Cancer. J Arak Uni Med Sci 2022; 25 (1) :14-27
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-7024-fa.html
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-7024-fa.html
هاشمی رضا، پیمانی مریم، قائدی کامران، صفار هانا. ارزیابی و مقایسه میزان بیان ژنهای PBK و E2F7 در سرطان کلورکتال بین مراحل اولیه و مراحل پیشرفته بیماری. مجله دانشگاه علوم پزشكي اراك. 1401; 25 (1) :14-27
رضا هاشمی1 
، مریم پیمانی 2، کامران قائدی1 ، هانا صفار1
، مریم پیمانی 2، کامران قائدی1 ، هانا صفار1
1- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران.
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران. ،m.peymani@iaushk.ac.ir
2- گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، شهرکرد، ایران. ،
متن کامل [PDF 5062 kb]
(606 دریافت)
| چکیده (HTML) (1104 مشاهده)
.jpg)
.jpg)
.jpg)
References
متن کامل: (1173 مشاهده)
مقدمه
سرطان به‌عنوان عامل اصلی مرگ و مانع مهمی برای افزایش امید به زندگی در هر کشوری از جهان شناخته می‌شود [1]. سرطان روده بزرگ عامل اصلی مرگ‌ومیر ناشی از سرطان در سراسر جهان است.دلیل این امر تجمع تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در سلول‌های اپیتلیال روده بزرگ است که آن‌ها را به آدنوکارسینوما تبدیل می‌کند [2]. سرطان کولورکتال سومین سرطان بدخیم و دومین سرطان کشنده است که بر اساس تخمین‌ها باعث 1,148,515 مورد ابتلا و 0/9 میلیون مرگ در سراسر جهان در سال 2020 شده است [3]. سرطان کولورکتال در بین سرطان‌های شایع، یکی از چالش‌برانگیزترین آن‌هاست که هتروژنی بالا در سطح بیان ژن، جهش‌های شایع در ژنهای کلیدی، بقا و رفتارهای مولکولی متفاوت در مراحل مختلف مهم‌ترین چالش‌های آن درنظر گرفته می‌شوند [4].
طبقه‌بندی مراحل مختلف تومور یکی از اساسی‌ترین گام‌ها در سرطان کولورکتال به شمار می‌آید. تعدادی از معیارهای مرحله‌بندی برای برآورد عمق نفوذ سرطان در روده بزرگ و همچنین میزان درگیری بیماری‌های خارج از روده بزرگ استفاده شده است. درحال‌حاضر، یک روش مرحله‌بندی رایج برای سرطان روده بزرگ بر اساس سیستم TNM (تومور/ گره/ متاستاز) است [5]. تشخیص در مراحل مختلف بالینی CRC ممکن است تا حدی تفاوت‌های قابل‌توجه در میزان بقا را توضیح دهد. تشخیص در مراحل پیشرفته یکی از عوامل تعیین‌کننده تفاوت در بقا و تعداد زیادی از مرگ‌های CRC در سراسر جهان است. پیش‌آگهی بستگی زیادی به مرحله تومور در زمان تشخیص دارد. بقای پنج ساله بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال به‌ترتیب شامل 93، 83، 60 و 8 درصد در مراحل یک، دو، سه و چهار است [6].
بررسی ارتباط بیان ژنهای مختلف در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال با ویژگی‌های کلینکالی مانند مرحله بیماری می‌تواند باعث تخمین وضعیت بقا و وضعیت پیش‌آگهی بیماران و شناسایی بیمارانی که در معرض خطر بیشتری برای بازگشت مجدد قرار دارند، شود. برای مثال نتایج مطالعات قبلی نشان دادند بیان ZEB2 در بیماران مبتلا به گره منفی (Stage I+II) با کاهش قابل‌توجه بقای کل همراه بوده است [7]. همچنین نشان داده شده است سطوح بیان بالای TBL1XR1 در مراحل اولیه بیماران CRC، خطر بالای متاستازهای کبدی را نشان می‌دهند که این نتایج ضرورت ارزیابی سطح بیان ژن‌ها در مراحل مختلف سرطان کولورکتال به‌عنوان مارکرهای زیستی را نشان می‌دهد [8].
PBK (اتصال‌دهنده PDZ کیناز) به‌عنوان پروتئین کیناز منشأ سلول‌های کشنده فعال‌شده با T-لنفوکین (TOPK) شناخته می‌شود و در سرطان‌های مختلف مانند لنفوم، لوسمی، ملانوم، روده بزرگ، سرطان سینه، ریه و گلیوما به‌شدت بیان می‌شود. PBK یک پروتئین کیناز فعال‌شده با میتوژن (MAPKK) بین MEK1/2 و MEK7 است و می‌تواند P38 ،JNK و ERK را در بسیاری از عملکردهای سلولی فسفریله کند [9]. علاوه‌براین، گزارش شده است PBK/TOPK نقش مهمی در التهاب، آپوپتوز سلولی و تنظیم چرخه سلولی دارد و بیان زیاد PBK/TOPK به رشد، تکثیر و متاستاز تومور کمک می‌کند [10].
E2F گروهی از ژن‌ها هستند که خانواده عوامل رونویسی (TF) را کد می‌کند و ژنهای دخیل در تکثیر، تمایز و آپوپتوز سلول را تنظیم می‌کند. برخی گزارش‌ها بیان غیرطبیعی E2F7 را با سرطان مرتبط می‌دانند. برای مثال افزایش بیان E2F7 در سرطان سلول‌های سنگ‌فرشی و کاهش بیان آن در سرطان تخمدان گزارش شده است [11]. خانواده عوامل رونویسی E2F مهم هستند، زیرا متعلق به گروهی از تنظیم‌کننده‌های سلولی‌اند که هم به‌صورت انکوژن و هم ژنهای سرکوب‌کننده تومور عمل می‌کنند [12].
باتوجه‌به اهمیت دو ژن E2F7 و PBK در روند پیشرفت سرطان‌ها، ارزیابی سطح بیان این ژن‌ها در بسیاری از سرطان‌ها مطالعه شده است، اما تاکنون بیان این دو ژن در مراحل مختلف سرطان کلورکتال و همچنین پتانسیل این ژن‌ها به‌عنوان مارکرهای زیستی در مراحل اولیه گزارش نشده است. ازاین‌رو در این پژوهش با استفاده از بافت‌های توموری سرطان کولورکتال و همچنین آزمون‌های PCR در زمان واقعی (RT-PCR)، سطح بیان ژنهای موردنظر در مراحل اولیه و پیشرفته بررسی شده است. همچنین برای تأیید نتایج به‌دست‌آمده، سطح بیان این ژن‌ها در اطلس ژنوم سرطان تأیید شد.
مواد و روش‌ها
نوع مطالعه و نمونه‌گیری
تحقیق حاضر از نوع مورد‌ـ‌شاهدی است و بیان ژن‌ها در نمونه‌های توموری پیشرفته به‌عنوان گروه آزمایش با نمونه‌های توموری در مراحل اولیه، به‌عنوان گروه کنترل مقایسه شد. برای انجام این مطالعه از بافت توموری 32 فرد مبتلا به سرطان کلورکتال در مراحل مختلف نمونه‌گیری انجام شد. پاتولوژیست نمونه بافت‌های این مطالعه را بررسی کرد و طبق معیارهای گزارش‌شده، توموری بودن آن‌ها را به تأیید رساند. از تمام بیماران دردسترس، فرم رضایت‌نامه دریافت شد.
ویژگی‌های کلینیکی نمونه‌های جمع‌آوری‌شده در جدول شماره 1 گزارش شده است.
.jpg)
نمونه‌های بافت پس از جراحی درون محلول RNA Latter (بهنوژن و ساخت کشور ایران) قرار داده شد و به مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل شدند. سپس نمونه‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه و سپس در دمای منفی 20 درجه فریز شدند.
استخراج RNA و سنتز cDNA
در این مطالعه برای استخراج RNA تام از ترایزول (Invitrogen ساخت کشور امریکا) مطابق پروتکل استفاده شد و RNA استخراج‌شده ازنظر کیفی و کمی بررسی شد. از تیمار RNهای استخراج‌شده در حضور آنزیم DNaseІ (سیناژن ساخت کشور ایران) 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای حذف آلودگی احتمالی RNA استخراج‌شده به DNA ژنومی استفاده شد و برای خنثی‌سازی آنزیم DNaseI هر نمونه با یک میکرولیتر اتیلن دی‌آمین تترا استیک اسید (مرک ساخت کشور آلمان) تیمار و به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. درنهایت برای سنتز cDNA، از کیت شرکت یکتا تجهیز آزما و پرایمر شش نوکلئوتیدی تصادفی استفاده شد.
تکنیک Real time RT-PCR
برای بررسی میزان بیان ژنهای موردنظر، نرم‌افزارهای Beacon Designer 0/8 وOligo7 پرایمرهای رفتوبرگشت اختصاصی هر ژن را طراحی کردند و پس از BLAST در پایگاه اینترنتی NCBI، شرکت پیشگام آن‌ها را سنتز کرد. در جدول شماره 2 توالی آغازگرهای PBK ،E2F7 و GAPDH [13] در روش RT-qPCR به همراه اندازه محصول و دمای بهینه برای تکثیر ژن‌ها ارائه شده است.
.jpg)
سپس بهینه‌سازی دمایی پرایمرها با روش PCR انجام شد. در پژوهش حاضر از تکنیک Real Time–RT PCR (دستگاه Corbett rotor gene 6000) برای سنجش کمی سطح بیان ژنهای مورد نظر استفاده شد. برای انجام این تکنیک از میکس SYBR Green (یکتاتجهیز آزما ساخت کشور ایران) استفاده شد. واکنش در حجم 10 میکرولیتر، شامل 5 میکرولیتر میکس SYBR Green، 1 میکرولیتر cDNA و 0/5 میکرولیتر از هرکدام از پرایمرهای رفتوبرگشت ژن‌هاست. درنهایت، پس از محاسبه، بیان ژن هدف در مراحل مختلف نسبت به یکدیگر با فرمول محاسبه شد.
تحلیل داده‌های پایگاه اطلس ژنوم سرطان
تمام داده‌های RNAseq در فرمت خام (HTseq-Counts) با استفاده از بسته TCGAbiolinks از اطلس ژنوم سرطان در محیط زبان برنامه‌نویسی R دانلود شد. در ادامه، پیش‌پردازش‌های اولیه بر داده‌های بیانی شامل حذف ژنهای با بیان صفر یا نزدیک به صفر (CPM کمتر از 10 در 50 درصد نمونه‌ها)، نرمال‌سازی داده‌ها به روش TMM و انتقال داده‌ها به حالت لگاریتمی بر پایه 2، توسط پکیج‌های limma و edgeR انجام شد. از ماتریکس بیانی حاصل هر سرطان برای آنالیزهای بعد در این مطالعه استفاده شد. بر اساس اطلاعات کلینیکی نمونه‌ها، اطلاعات مربوط به Stage هرکدام از نمونه‌ها استخراج شد و نمونه‌ها در دو گروه Stage I/II (n=268) و Stage III/IV(n=199) طبقه‌بندی شدند و بیان دو ژن مورد نظر بین دو گروه مطالعه، مقایسه شد.
تحلیل‌های آماری
برای بررسی بیان نسبی ژنهای PBK و E2F7 در سرطان روده بزرگ از نرم‌افزارهای GraphPad Prism و اکسل استفاده شد و پس از تأیید نرمال بودن حجم نمونه با آزمون شاپیرو ویلک Shapiro، برای مقایسه بیان ژن‌ها در مراحل مختلف از آزمون ماتریکس یک‌طرفه استفاده شد.
یافته‌ها
بررسی و مقایسه بیان PKB و E2F7 در دو گروه Stage I/II و Stage III/IV در نمونه‌های توموری جمع‌آوری‌شده
در این مطالعه، سطح بیان PKB و E2F7 در stageهای مختلف بیماری در بافت‌های توموری با استفاده از تکنیک Real time RT-qPCR و نیز با روش Ct Δ آنالیز شد. نتایج نشان داد سطح بیان این ژن‌ها در مراحل مختلف بیماری تغییر معناداری داشته است (تصویر شماره 1).
سرطان به‌عنوان عامل اصلی مرگ و مانع مهمی برای افزایش امید به زندگی در هر کشوری از جهان شناخته می‌شود [1]. سرطان روده بزرگ عامل اصلی مرگ‌ومیر ناشی از سرطان در سراسر جهان است.دلیل این امر تجمع تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی در سلول‌های اپیتلیال روده بزرگ است که آن‌ها را به آدنوکارسینوما تبدیل می‌کند [2]. سرطان کولورکتال سومین سرطان بدخیم و دومین سرطان کشنده است که بر اساس تخمین‌ها باعث 1,148,515 مورد ابتلا و 0/9 میلیون مرگ در سراسر جهان در سال 2020 شده است [3]. سرطان کولورکتال در بین سرطان‌های شایع، یکی از چالش‌برانگیزترین آن‌هاست که هتروژنی بالا در سطح بیان ژن، جهش‌های شایع در ژنهای کلیدی، بقا و رفتارهای مولکولی متفاوت در مراحل مختلف مهم‌ترین چالش‌های آن درنظر گرفته می‌شوند [4].
طبقه‌بندی مراحل مختلف تومور یکی از اساسی‌ترین گام‌ها در سرطان کولورکتال به شمار می‌آید. تعدادی از معیارهای مرحله‌بندی برای برآورد عمق نفوذ سرطان در روده بزرگ و همچنین میزان درگیری بیماری‌های خارج از روده بزرگ استفاده شده است. درحال‌حاضر، یک روش مرحله‌بندی رایج برای سرطان روده بزرگ بر اساس سیستم TNM (تومور/ گره/ متاستاز) است [5]. تشخیص در مراحل مختلف بالینی CRC ممکن است تا حدی تفاوت‌های قابل‌توجه در میزان بقا را توضیح دهد. تشخیص در مراحل پیشرفته یکی از عوامل تعیین‌کننده تفاوت در بقا و تعداد زیادی از مرگ‌های CRC در سراسر جهان است. پیش‌آگهی بستگی زیادی به مرحله تومور در زمان تشخیص دارد. بقای پنج ساله بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال به‌ترتیب شامل 93، 83، 60 و 8 درصد در مراحل یک، دو، سه و چهار است [6].
بررسی ارتباط بیان ژنهای مختلف در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال با ویژگی‌های کلینکالی مانند مرحله بیماری می‌تواند باعث تخمین وضعیت بقا و وضعیت پیش‌آگهی بیماران و شناسایی بیمارانی که در معرض خطر بیشتری برای بازگشت مجدد قرار دارند، شود. برای مثال نتایج مطالعات قبلی نشان دادند بیان ZEB2 در بیماران مبتلا به گره منفی (Stage I+II) با کاهش قابل‌توجه بقای کل همراه بوده است [7]. همچنین نشان داده شده است سطوح بیان بالای TBL1XR1 در مراحل اولیه بیماران CRC، خطر بالای متاستازهای کبدی را نشان می‌دهند که این نتایج ضرورت ارزیابی سطح بیان ژن‌ها در مراحل مختلف سرطان کولورکتال به‌عنوان مارکرهای زیستی را نشان می‌دهد [8].
PBK (اتصال‌دهنده PDZ کیناز) به‌عنوان پروتئین کیناز منشأ سلول‌های کشنده فعال‌شده با T-لنفوکین (TOPK) شناخته می‌شود و در سرطان‌های مختلف مانند لنفوم، لوسمی، ملانوم، روده بزرگ، سرطان سینه، ریه و گلیوما به‌شدت بیان می‌شود. PBK یک پروتئین کیناز فعال‌شده با میتوژن (MAPKK) بین MEK1/2 و MEK7 است و می‌تواند P38 ،JNK و ERK را در بسیاری از عملکردهای سلولی فسفریله کند [9]. علاوه‌براین، گزارش شده است PBK/TOPK نقش مهمی در التهاب، آپوپتوز سلولی و تنظیم چرخه سلولی دارد و بیان زیاد PBK/TOPK به رشد، تکثیر و متاستاز تومور کمک می‌کند [10].
E2F گروهی از ژن‌ها هستند که خانواده عوامل رونویسی (TF) را کد می‌کند و ژنهای دخیل در تکثیر، تمایز و آپوپتوز سلول را تنظیم می‌کند. برخی گزارش‌ها بیان غیرطبیعی E2F7 را با سرطان مرتبط می‌دانند. برای مثال افزایش بیان E2F7 در سرطان سلول‌های سنگ‌فرشی و کاهش بیان آن در سرطان تخمدان گزارش شده است [11]. خانواده عوامل رونویسی E2F مهم هستند، زیرا متعلق به گروهی از تنظیم‌کننده‌های سلولی‌اند که هم به‌صورت انکوژن و هم ژنهای سرکوب‌کننده تومور عمل می‌کنند [12].
باتوجه‌به اهمیت دو ژن E2F7 و PBK در روند پیشرفت سرطان‌ها، ارزیابی سطح بیان این ژن‌ها در بسیاری از سرطان‌ها مطالعه شده است، اما تاکنون بیان این دو ژن در مراحل مختلف سرطان کلورکتال و همچنین پتانسیل این ژن‌ها به‌عنوان مارکرهای زیستی در مراحل اولیه گزارش نشده است. ازاین‌رو در این پژوهش با استفاده از بافت‌های توموری سرطان کولورکتال و همچنین آزمون‌های PCR در زمان واقعی (RT-PCR)، سطح بیان ژنهای موردنظر در مراحل اولیه و پیشرفته بررسی شده است. همچنین برای تأیید نتایج به‌دست‌آمده، سطح بیان این ژن‌ها در اطلس ژنوم سرطان تأیید شد.
مواد و روش‌ها
نوع مطالعه و نمونه‌گیری
تحقیق حاضر از نوع مورد‌ـ‌شاهدی است و بیان ژن‌ها در نمونه‌های توموری پیشرفته به‌عنوان گروه آزمایش با نمونه‌های توموری در مراحل اولیه، به‌عنوان گروه کنترل مقایسه شد. برای انجام این مطالعه از بافت توموری 32 فرد مبتلا به سرطان کلورکتال در مراحل مختلف نمونه‌گیری انجام شد. پاتولوژیست نمونه بافت‌های این مطالعه را بررسی کرد و طبق معیارهای گزارش‌شده، توموری بودن آن‌ها را به تأیید رساند. از تمام بیماران دردسترس، فرم رضایت‌نامه دریافت شد.
ویژگی‌های کلینیکی نمونه‌های جمع‌آوری‌شده در جدول شماره 1 گزارش شده است.
نمونه‌های بافت پس از جراحی درون محلول RNA Latter (بهنوژن و ساخت کشور ایران) قرار داده شد و به مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد منتقل شدند. سپس نمونه‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه و سپس در دمای منفی 20 درجه فریز شدند.
استخراج RNA و سنتز cDNA
در این مطالعه برای استخراج RNA تام از ترایزول (Invitrogen ساخت کشور امریکا) مطابق پروتکل استفاده شد و RNA استخراج‌شده ازنظر کیفی و کمی بررسی شد. از تیمار RNهای استخراج‌شده در حضور آنزیم DNaseІ (سیناژن ساخت کشور ایران) 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای حذف آلودگی احتمالی RNA استخراج‌شده به DNA ژنومی استفاده شد و برای خنثی‌سازی آنزیم DNaseI هر نمونه با یک میکرولیتر اتیلن دی‌آمین تترا استیک اسید (مرک ساخت کشور آلمان) تیمار و به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. درنهایت برای سنتز cDNA، از کیت شرکت یکتا تجهیز آزما و پرایمر شش نوکلئوتیدی تصادفی استفاده شد.
تکنیک Real time RT-PCR
برای بررسی میزان بیان ژنهای موردنظر، نرم‌افزارهای Beacon Designer 0/8 وOligo7 پرایمرهای رفتوبرگشت اختصاصی هر ژن را طراحی کردند و پس از BLAST در پایگاه اینترنتی NCBI، شرکت پیشگام آن‌ها را سنتز کرد. در جدول شماره 2 توالی آغازگرهای PBK ،E2F7 و GAPDH [13] در روش RT-qPCR به همراه اندازه محصول و دمای بهینه برای تکثیر ژن‌ها ارائه شده است.
سپس بهینه‌سازی دمایی پرایمرها با روش PCR انجام شد. در پژوهش حاضر از تکنیک Real Time–RT PCR (دستگاه Corbett rotor gene 6000) برای سنجش کمی سطح بیان ژنهای مورد نظر استفاده شد. برای انجام این تکنیک از میکس SYBR Green (یکتاتجهیز آزما ساخت کشور ایران) استفاده شد. واکنش در حجم 10 میکرولیتر، شامل 5 میکرولیتر میکس SYBR Green، 1 میکرولیتر cDNA و 0/5 میکرولیتر از هرکدام از پرایمرهای رفتوبرگشت ژن‌هاست. درنهایت، پس از محاسبه، بیان ژن هدف در مراحل مختلف نسبت به یکدیگر با فرمول محاسبه شد.
تحلیل داده‌های پایگاه اطلس ژنوم سرطان
تمام داده‌های RNAseq در فرمت خام (HTseq-Counts) با استفاده از بسته TCGAbiolinks از اطلس ژنوم سرطان در محیط زبان برنامه‌نویسی R دانلود شد. در ادامه، پیش‌پردازش‌های اولیه بر داده‌های بیانی شامل حذف ژنهای با بیان صفر یا نزدیک به صفر (CPM کمتر از 10 در 50 درصد نمونه‌ها)، نرمال‌سازی داده‌ها به روش TMM و انتقال داده‌ها به حالت لگاریتمی بر پایه 2، توسط پکیج‌های limma و edgeR انجام شد. از ماتریکس بیانی حاصل هر سرطان برای آنالیزهای بعد در این مطالعه استفاده شد. بر اساس اطلاعات کلینیکی نمونه‌ها، اطلاعات مربوط به Stage هرکدام از نمونه‌ها استخراج شد و نمونه‌ها در دو گروه Stage I/II (n=268) و Stage III/IV(n=199) طبقه‌بندی شدند و بیان دو ژن مورد نظر بین دو گروه مطالعه، مقایسه شد.
تحلیل‌های آماری
برای بررسی بیان نسبی ژنهای PBK و E2F7 در سرطان روده بزرگ از نرم‌افزارهای GraphPad Prism و اکسل استفاده شد و پس از تأیید نرمال بودن حجم نمونه با آزمون شاپیرو ویلک Shapiro، برای مقایسه بیان ژن‌ها در مراحل مختلف از آزمون ماتریکس یک‌طرفه استفاده شد.
یافته‌ها
بررسی و مقایسه بیان PKB و E2F7 در دو گروه Stage I/II و Stage III/IV در نمونه‌های توموری جمع‌آوری‌شده
در این مطالعه، سطح بیان PKB و E2F7 در stageهای مختلف بیماری در بافت‌های توموری با استفاده از تکنیک Real time RT-qPCR و نیز با روش Ct Δ آنالیز شد. نتایج نشان داد سطح بیان این ژن‌ها در مراحل مختلف بیماری تغییر معناداری داشته است (تصویر شماره 1).
همان‌طور که ملاحظه می‌شود، سطح بیان PBK و E2F7 در Stage I+II به‌ترتیب 1/3 و 2/5 برابر بیش از سایر Stageهاست (تصویر شماره 1).
بررسی و مقایسه بیان PKB و E2F7 در دو گروه Stage I/II و Stage III/IV بر اساس اطلاعات اطلس ژنوم سرطان
سطح بیان PKB و E2F7 در بافت‌های توموری روده بزرگ که اطلاعات stageها و بیان آن‌ها از اطلس ژنوم سرطان استخراج شد، در دو گروه Stage I+II و Stage III+IV مقایسه شد. نتایج نشان داد هر دو ژن در مراحل اولیه بیماری افزایش بیان معناداری را نشان می‌دهند (تصویر شماره 2).
بررسی و مقایسه بیان PKB و E2F7 در دو گروه Stage I/II و Stage III/IV بر اساس اطلاعات اطلس ژنوم سرطان
سطح بیان PKB و E2F7 در بافت‌های توموری روده بزرگ که اطلاعات stageها و بیان آن‌ها از اطلس ژنوم سرطان استخراج شد، در دو گروه Stage I+II و Stage III+IV مقایسه شد. نتایج نشان داد هر دو ژن در مراحل اولیه بیماری افزایش بیان معناداری را نشان می‌دهند (تصویر شماره 2).
اختصاصیت و حساسیت PBK و E2F7 در جداسازی Stagهای اولیه از Stageهای بالاتر بر اساس اطلاعات اطلس ژنوم سرطان
نتایج بر اساس نمودار ROC curve نشان داد مارکرهای PBK و E2F7 به‌ترتیب با مساحت‌های زیر سطح نمودار AUC=0/7035 و AUC=0/8323 به‌عنوان ژنهای معناداری در جداسازی تومورهای Stage I+II از Stage III+IV عمل خواهند کرد (0001/P>0) (تصویر شماره 3).
نتایج بر اساس نمودار ROC curve نشان داد مارکرهای PBK و E2F7 به‌ترتیب با مساحت‌های زیر سطح نمودار AUC=0/7035 و AUC=0/8323 به‌عنوان ژنهای معناداری در جداسازی تومورهای Stage I+II از Stage III+IV عمل خواهند کرد (0001/P>0) (تصویر شماره 3).
بحث
مطالعه ژنتیک مولکولی و بررسی سطح بیان ژنهای با اهمیت زیاد در مراحل مختلف برای درک بیشتر پاتوژنز و تشخیص زودهنگام سرطان کولورکتال مفید است. بنابراین، تشخیص سطح بیان ژنهای PBK و E2F7 در مراحل اولیه و پیشرفته سرطان کولورکتال به‌وسیله آنالیز PCR در زمان واقعی و همچنین تأیید نتایج حاصل به‌وسیله مجموعه داده‌های ترانسکریپتوم (TCGA) ممکن است به تشخیص زودهنگام کمک کند و درمان‌های مؤثری را ممکن سازد.
ژنهای PBK و E2F7 در سرطان‌های مختلف به‌عنوان مارکرهای زیستی درنظر گرفته شدند. ازاین‌رو در این مطالعه، برای اولین بار، ژنهای PBK و E2F7 به‌عنوان ژنهای با پتانسیل تشخیصی در مراحل اولیه سرطان کولورکتال انتخاب شدند. سطح بیان این ژن‌ها در مراحل اولیه و ثانویه سرطان کولورکتال به‌وسیله 32 بافت توموری و در مراحل مختلف، با استفاده از آنالیز داده‌های PCR در زمان واقعی ارزیابی شد. سپس نتایج به‌دست‌آمده به‌وسیله داده‌های اطلس ژنوم سرطان تأیید شد. PBK یک سرین/ترئونین پروتئین کیناز مربوط به خانواده پروتئین کیناز (MAPKK) فعال‌شده با میتوژن است. نتایج مطالعات انجام‌شده بر روی سرطان معده نشان داد، بیان هسته‌ای PBK با افزایش عمق تهاجم و متاستاز به غدد لنفاوی ارتباط معناداری دارد. از طرفی نتایج حاصل از تجزیهوتحلیل بقایKaplan-/Meier نشان داد، افزایش بیان ژن PBK بقای بیماران را کاهش می‌دهد. این نتایج نشان می‌دهد PBK، سرطان‌زایی و متاستاز سرطان معده را افزایش می‌دهد و نشانگر زیستی بالقوه‌ای در برای پیش‌آگهی بیماری است. علاوه‌براین، PBK نشانگر پروتئین ایمونوهیستوشیمی مفیدی برای کاربرد بالقوه آسیب‌شناسی جراحی است، زیرا پیش‌بینی متاستاز غدد لنفاوی بر اساس ارزیابی نمونه بیوپسی، قبل از برداشتن آندوسکوپی یک نقطه تصمیم‌گیری حیاتی است [14]. نتایج آنالیز داده‌های آزمایشگاهی نشان داد، سطح بیان ژن PBK در مراحل اولیه در مقایسه با مراحل پیشرفته بیشتر بود. همچنین نتایج حاصل از داده‌های ترنسکیپتوم نیز نشان داد، سطح بیان این ژن در مراحل ابتدایی بیشتر از مراحل پیشرفته است. مطالعات مربوط به همبستگی بین PBK/TOPK و بدخیمی‌ها در سال‌های اخیر تأیید کرده است که PBK/TOPK در سلول‌های تکثیری بیش‌ازحد بیان می‌شود. برای مثال PBK/TOPK در طول سیتوژنز سلول‌های توموری به‌احتمال‌زیاد با فسفوریلاسیون Thr9 و فعال شدن توسط سیکلینB1/cdk1 افزایش می‌یابد [15, 16]. بنابراین، فرض بر این است که PBK/TOPK نقش مهمی در سیتوکینزیس ایفا می‌کند. اخیراً یک مطالعه نشان داد کاهش بیان PBK/TOPK به‌طور قابل‌توجهی با پیش‌آگهی ضعیف در بیماران مبتلابه کلانژیوکارسینوم مرتبط است [17]. مطالعه دیگری گزارش کرد که بیانPBK/TOPK به‌دلیل مهار EWS -FLI1 کاهش می‌یابد و باعث کاهش سرعت تکثیر سلولی می‌شود. همچنین مشخص شده است که پارامترهای دیگری غیر از بیان PBK/TOPK بر تومورزایی تأثیر می‌گذارد. یافته‌های اخیر نشان می‌دهد PBK/TOPK را می‌توان ژنی مرتبط با سیتوژنز در سلول‌های تومور دانست. احتمالاً مسیرهای سیگنالینگ دیگری نیز وجود دارند که می‌توانند بر روند بالینی CRC تأثیر بگذارند. همچنین یکی از مطالعات اخیر در سرطان کولورکتال نشان داده است که بیان کم این ژن با پیش‌آگهی ضعیف بیماران ارتباط دارد [18]. نتایج مطالعه انجام‌شده بر روی سرطان کولورکتال نشان می‌دهد که بیان بیش‌ازحد PBK ممکن است، بقای سلول‌های تومور و مقاومت در برابر آپوپتوز ناشی از شیمی‌درمانی را ازطریقِ سرکوب بیان p21 و عملکرد p53 افزایش دهد. یکی از پیش‌بینی‌های این مدل این است که کاهش PBK در سلول‌های تومور باید تکثیر و تومورزایی را ازطریقِ افزایش بیان p21 و عملکرد p53 کاهش دهد. درواقع، سه رده سلولی پایدار PBK در فاز G2/M چرخه سلولی تجمع و آپوپتوز را پس از قرار گرفتن در معرض DMSO یا دوکسوروبیسین در مقایسه با سلول‌های کنترلی که حامل shRNAهای غیراختصاصی بودند، نشان دادند [19]. یافته‌های اخیر درباره سرطان کولورکتال، ارتباط معنادار بین ژن PBK و مارکرهای تکثیر سلولی را در هر دو محیط in vivo و in vitro نشان داده است. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد سطح بیان ژن PBK در سرطان کولورکتال با TNM.T ارتباط معکوس داشت. علاوه‌براین، یافته‌های مطالعات اخیر نشان داده است که بر اساس نتایج به‌دست‌آمده از سطح بیان ژن PBK در سرطان کولورکتال و همچنین بر اساس ارتباط بیان این ژن با تکثیر سلولی، ژن PBK ممکن است به‌عنوان یک هدف درمانی در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال در نظر گرفته شود [20]. ازطرفی، نتایج آنالیز منحنی ROC بر اساس داده‌های ترنسکریپتوم توانست به‌صورت معناداری بیمارانی که در مراحل ابتدایی بیماری به سر می‌برند را از بیمارانی که در مراحل پیشرفته بیماری هستند، تفکیک کند. درنهایت، باتوجه‌به نتایج مطالعات قبلی و نتایج حاصل از داده‌های آزمایشگاهی و بیوانفورماتیک، می‌توان نتیجه‌گیری کرد که ارزیابی سطح بیان ژن PBK در مراحل ابتدایی ممکن است در روند تشخیص زودهنگام بیماری مؤثر واقع شود و به‌عنوان یک مارکر تشخیصی کارآمد باشد.
فاکتورهای رونویسی E2F تنظیم‌کننده‌های مهم چرخه سلولی هستند و تنظیم نادرست رونویسی وابسته به E2F یک رویداد مکرر در بسیاری از سرطان‌هاست و تصور می‌شود محرک مهمی در تکثیر بی‌رویه سلول‌های سرطانی است. برخی از مطالعات نشان می‌دهد E2Fهای غیرمعمول ممکن است به‌عنوان آنکوژن عمل کنند، درحالی‌که مطالعات دیگر نتیجه گرفتند که آن‌ها می‌توانند، مهارکننده تومور باشند و این نشان می‌دهد نقش E2F7 به نوع بافت بستگی دارد [21]. نتایج داده‌های ریل تایم نشان داد، سطح بیان این ژن در مرحله یک و دو در مقایسه با مرحله سه و چهار بیشتر است. همان‌طور که این نتایج در تحلیل تفاوت بیان داده‌های اطلس ژنوم سرطان نیز تأیید شد. همچنین نتایج تحلیل منحنی ROC بر اساس داده‌های اطلس ژنوم سرطان نشان داد ژن E2F7 می‌تواند به‌عنوان یک مارکر زیستی در مراحل ابتدایی سرطان کولورکتال مؤثر واقع شود. مطالعات گذشته نشان دادند بیان E2F7 در بافت‌های سرطان پروستات در مقایسه با بافت‌های طبیعی مجاور به میزان چشمگیری بیشتر است [22]. چنگ و همکاران دریافتند پس از ناک‌داون کردن E2F7، تکثیر، تهاجم و مهاجرت سلولی به‌طور قابل‌توجهی مهارشده و آپوپتوز ایجاد می‌شود. علاوه‌براین، ازطریق روش وسترن بلات، مشاهده کردند که بیان پروتئین BCL-2 کاهش می‌یابد، درحالی‌که بیان پروتئین BAX و CLE-caspase3 افزایش می‌یابد. این نشان می‌دهد، مهار E2F7 می‌تواند باعث آپوپتوز سلولی شود و درنتیجه از تکثیر، تهاجم و مهاجرت سلولی جلوگیری می‌کند [23]. ازطرفی یک مطالعه انجام‌شده بر روی سرطان گلیوما نشان داد، سطح بیان ژن E2F7 در مراحل پیشرفته، بیشتر از مراحل ابتدایی است [24]. علاوه‌براین نشان داده شده است بیان E2F7 به‌طور قابل‌توجهی با مراحل تومور و بقای کلی بیماران مبتلابه سرطان روده بزرگ مرتبط است و درنتیجه این ژن ممکن است به‌عنوان هدف درمانی بالقوه برای سرطان روده بزرگ عمل کند [25]. نتایج مطالعه صورت‌گرفته بر سرطان کولورکتال در سال 2021 نشان داد E2F7 پایداری MAPK را برای افزایش و تکثیر سلولی، تهاجم و مهاجرت در سرطان روده بزرگ را ارتقا داد [26]. ازطرفی به‌طور مشابه، مطالعه دیگری، ارتباط مسیر سیگنالینگ MAPK را با رشد سرطان روده بزرگ در داخل بدن نشان داده است [27]. همچنین مشخص شده است MAPK فعالیت سلول‌های بنیادی تومور سرطان روده را ارتقا می‌دهد [28]. مطالعات قبلی، نقش مهاری E2F7 را در بیان ژنهای پایین‌دست آن گزارش کرده است [29]. علاوه‌براین، miR-199b-5p در سرطان کولورکتال بیان کمی دارد [30]. نتایج تشخیص تراشه نشان داد پس از خاموش کردن E2F7، اتصال E2F7 به پروموتر miR-199b کاهش یافت و درنتیجه بیانmiR-199b را تقویت کرد. به‌طور خلاصه، E2F7 بیان miR-199b را با اتصال به پروموتر miR-199b در سرطان کولورکتال کاهش می‌دهد [26]. ازین‌رو ارزیابی سطح بیان این ژن در مراحل اولیه نسبت به مراحل پیشرفته و بررسی پتانسیل تشخیصی وابسته به سطح بیان در مراحل ابتدایی ممکن است در بهبود روند درمان و تشخیص بیماران مبتلابه سرطان کولورکتال مؤثر باشد.
نتیجه‌گیری
یافته‌های این مطالعه نشان داد ژنهای PBK و E2F7 در مراحل ابتدایی نسبت به مراحل پیشرفته، سطح بیان بیشتری دارند. این نتایج پیشنهاد می‌کنند ژنهای PBK و E2F7 پتانسیل به‌کارگیری به‌عنوان مارکرهای زیستی را در مراحل ابتدایی دارند، اگرچه مطالعات بیشتری برای تأیید این یافته‌ها نیاز است. علاوه‌براین سطح بیان ژنهای کاندید در مراحل ابتدایی به‌خوبی از مراحل پیشرفته قابل‌تمایز و تفکیک است. ازین‌رو مطالعات مولکولی بیشتری نیز برای ارائه تصویری عمیق‌تر در مورد عملکرد PBK و E2F7 در سرطان کولورکتال لازم است.
از محدودیت‌های این مطالعه می‌توان به دسترسی بسیار کم به نمونه‌های توموری در مراحل پیشرفته و همچنین ممکن نبودن پیگیری روند پیشرفت بیماری در نمونه‌های جمع‌آوری‌شده، اشاره کرد. پیشنهاد می‌شود ژنهای بیشتری برای معرفی بیومارکر در جهت جداسازی دو جمعیت توموری در مراحل اولیه و پیشرفته بررسی شوند. همچنین در مدل‌های سلولی سرطان کلورکتال، به عملکرد این ژن‌ها در جهت تأیید نقش آن‌ها در روند پیشرفت بیماری پرداخته شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این پژوهش در کمیته اخلاق دانشگاه آزاد شهرکرد با کد IR.IAU.SHK.REC.1399.022 به تصویب رسیده است.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایان‌نامه دکتری تخصصی گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی است و با حمایت معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه آزاد شهرکرد انجام شده است.
مشارکت نویسندگان
طراحی و مفهوم‌سازی مطالعه و روش‌شناسی: رضا هاشمی و مریم پیمانی؛ داده کاوی، تجزیهوتحلیل رسمی و بررسی: رضا هاشمی؛ نظارت، اعتبار سنجی، تجسم و تأیید نهایی: مریم پیمانی و کامران قائدی؛ تفسیر اطلاعات به‌دست‌آمده: مریم پیمانی؛: جمع‌آوری نمونه: هانا صفار؛ نگارش مقاله، بازنگری و ویرایش: رضا هاشمی؛ همه نویسندگان نسخه نهایی را خواندند و تأیید کردند
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از تمام افرادی که در جمع‌آوری نمونه‌های خون در این پژوهش یاری رساندند، تشکر و قدردانی می‌کنند.
مطالعه ژنتیک مولکولی و بررسی سطح بیان ژنهای با اهمیت زیاد در مراحل مختلف برای درک بیشتر پاتوژنز و تشخیص زودهنگام سرطان کولورکتال مفید است. بنابراین، تشخیص سطح بیان ژنهای PBK و E2F7 در مراحل اولیه و پیشرفته سرطان کولورکتال به‌وسیله آنالیز PCR در زمان واقعی و همچنین تأیید نتایج حاصل به‌وسیله مجموعه داده‌های ترانسکریپتوم (TCGA) ممکن است به تشخیص زودهنگام کمک کند و درمان‌های مؤثری را ممکن سازد.
ژنهای PBK و E2F7 در سرطان‌های مختلف به‌عنوان مارکرهای زیستی درنظر گرفته شدند. ازاین‌رو در این مطالعه، برای اولین بار، ژنهای PBK و E2F7 به‌عنوان ژنهای با پتانسیل تشخیصی در مراحل اولیه سرطان کولورکتال انتخاب شدند. سطح بیان این ژن‌ها در مراحل اولیه و ثانویه سرطان کولورکتال به‌وسیله 32 بافت توموری و در مراحل مختلف، با استفاده از آنالیز داده‌های PCR در زمان واقعی ارزیابی شد. سپس نتایج به‌دست‌آمده به‌وسیله داده‌های اطلس ژنوم سرطان تأیید شد. PBK یک سرین/ترئونین پروتئین کیناز مربوط به خانواده پروتئین کیناز (MAPKK) فعال‌شده با میتوژن است. نتایج مطالعات انجام‌شده بر روی سرطان معده نشان داد، بیان هسته‌ای PBK با افزایش عمق تهاجم و متاستاز به غدد لنفاوی ارتباط معناداری دارد. از طرفی نتایج حاصل از تجزیهوتحلیل بقایKaplan-/Meier نشان داد، افزایش بیان ژن PBK بقای بیماران را کاهش می‌دهد. این نتایج نشان می‌دهد PBK، سرطان‌زایی و متاستاز سرطان معده را افزایش می‌دهد و نشانگر زیستی بالقوه‌ای در برای پیش‌آگهی بیماری است. علاوه‌براین، PBK نشانگر پروتئین ایمونوهیستوشیمی مفیدی برای کاربرد بالقوه آسیب‌شناسی جراحی است، زیرا پیش‌بینی متاستاز غدد لنفاوی بر اساس ارزیابی نمونه بیوپسی، قبل از برداشتن آندوسکوپی یک نقطه تصمیم‌گیری حیاتی است [14]. نتایج آنالیز داده‌های آزمایشگاهی نشان داد، سطح بیان ژن PBK در مراحل اولیه در مقایسه با مراحل پیشرفته بیشتر بود. همچنین نتایج حاصل از داده‌های ترنسکیپتوم نیز نشان داد، سطح بیان این ژن در مراحل ابتدایی بیشتر از مراحل پیشرفته است. مطالعات مربوط به همبستگی بین PBK/TOPK و بدخیمی‌ها در سال‌های اخیر تأیید کرده است که PBK/TOPK در سلول‌های تکثیری بیش‌ازحد بیان می‌شود. برای مثال PBK/TOPK در طول سیتوژنز سلول‌های توموری به‌احتمال‌زیاد با فسفوریلاسیون Thr9 و فعال شدن توسط سیکلینB1/cdk1 افزایش می‌یابد [15, 16]. بنابراین، فرض بر این است که PBK/TOPK نقش مهمی در سیتوکینزیس ایفا می‌کند. اخیراً یک مطالعه نشان داد کاهش بیان PBK/TOPK به‌طور قابل‌توجهی با پیش‌آگهی ضعیف در بیماران مبتلابه کلانژیوکارسینوم مرتبط است [17]. مطالعه دیگری گزارش کرد که بیانPBK/TOPK به‌دلیل مهار EWS -FLI1 کاهش می‌یابد و باعث کاهش سرعت تکثیر سلولی می‌شود. همچنین مشخص شده است که پارامترهای دیگری غیر از بیان PBK/TOPK بر تومورزایی تأثیر می‌گذارد. یافته‌های اخیر نشان می‌دهد PBK/TOPK را می‌توان ژنی مرتبط با سیتوژنز در سلول‌های تومور دانست. احتمالاً مسیرهای سیگنالینگ دیگری نیز وجود دارند که می‌توانند بر روند بالینی CRC تأثیر بگذارند. همچنین یکی از مطالعات اخیر در سرطان کولورکتال نشان داده است که بیان کم این ژن با پیش‌آگهی ضعیف بیماران ارتباط دارد [18]. نتایج مطالعه انجام‌شده بر روی سرطان کولورکتال نشان می‌دهد که بیان بیش‌ازحد PBK ممکن است، بقای سلول‌های تومور و مقاومت در برابر آپوپتوز ناشی از شیمی‌درمانی را ازطریقِ سرکوب بیان p21 و عملکرد p53 افزایش دهد. یکی از پیش‌بینی‌های این مدل این است که کاهش PBK در سلول‌های تومور باید تکثیر و تومورزایی را ازطریقِ افزایش بیان p21 و عملکرد p53 کاهش دهد. درواقع، سه رده سلولی پایدار PBK در فاز G2/M چرخه سلولی تجمع و آپوپتوز را پس از قرار گرفتن در معرض DMSO یا دوکسوروبیسین در مقایسه با سلول‌های کنترلی که حامل shRNAهای غیراختصاصی بودند، نشان دادند [19]. یافته‌های اخیر درباره سرطان کولورکتال، ارتباط معنادار بین ژن PBK و مارکرهای تکثیر سلولی را در هر دو محیط in vivo و in vitro نشان داده است. همچنین نتایج این مطالعه نشان داد سطح بیان ژن PBK در سرطان کولورکتال با TNM.T ارتباط معکوس داشت. علاوه‌براین، یافته‌های مطالعات اخیر نشان داده است که بر اساس نتایج به‌دست‌آمده از سطح بیان ژن PBK در سرطان کولورکتال و همچنین بر اساس ارتباط بیان این ژن با تکثیر سلولی، ژن PBK ممکن است به‌عنوان یک هدف درمانی در بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال در نظر گرفته شود [20]. ازطرفی، نتایج آنالیز منحنی ROC بر اساس داده‌های ترنسکریپتوم توانست به‌صورت معناداری بیمارانی که در مراحل ابتدایی بیماری به سر می‌برند را از بیمارانی که در مراحل پیشرفته بیماری هستند، تفکیک کند. درنهایت، باتوجه‌به نتایج مطالعات قبلی و نتایج حاصل از داده‌های آزمایشگاهی و بیوانفورماتیک، می‌توان نتیجه‌گیری کرد که ارزیابی سطح بیان ژن PBK در مراحل ابتدایی ممکن است در روند تشخیص زودهنگام بیماری مؤثر واقع شود و به‌عنوان یک مارکر تشخیصی کارآمد باشد.
فاکتورهای رونویسی E2F تنظیم‌کننده‌های مهم چرخه سلولی هستند و تنظیم نادرست رونویسی وابسته به E2F یک رویداد مکرر در بسیاری از سرطان‌هاست و تصور می‌شود محرک مهمی در تکثیر بی‌رویه سلول‌های سرطانی است. برخی از مطالعات نشان می‌دهد E2Fهای غیرمعمول ممکن است به‌عنوان آنکوژن عمل کنند، درحالی‌که مطالعات دیگر نتیجه گرفتند که آن‌ها می‌توانند، مهارکننده تومور باشند و این نشان می‌دهد نقش E2F7 به نوع بافت بستگی دارد [21]. نتایج داده‌های ریل تایم نشان داد، سطح بیان این ژن در مرحله یک و دو در مقایسه با مرحله سه و چهار بیشتر است. همان‌طور که این نتایج در تحلیل تفاوت بیان داده‌های اطلس ژنوم سرطان نیز تأیید شد. همچنین نتایج تحلیل منحنی ROC بر اساس داده‌های اطلس ژنوم سرطان نشان داد ژن E2F7 می‌تواند به‌عنوان یک مارکر زیستی در مراحل ابتدایی سرطان کولورکتال مؤثر واقع شود. مطالعات گذشته نشان دادند بیان E2F7 در بافت‌های سرطان پروستات در مقایسه با بافت‌های طبیعی مجاور به میزان چشمگیری بیشتر است [22]. چنگ و همکاران دریافتند پس از ناک‌داون کردن E2F7، تکثیر، تهاجم و مهاجرت سلولی به‌طور قابل‌توجهی مهارشده و آپوپتوز ایجاد می‌شود. علاوه‌براین، ازطریق روش وسترن بلات، مشاهده کردند که بیان پروتئین BCL-2 کاهش می‌یابد، درحالی‌که بیان پروتئین BAX و CLE-caspase3 افزایش می‌یابد. این نشان می‌دهد، مهار E2F7 می‌تواند باعث آپوپتوز سلولی شود و درنتیجه از تکثیر، تهاجم و مهاجرت سلولی جلوگیری می‌کند [23]. ازطرفی یک مطالعه انجام‌شده بر روی سرطان گلیوما نشان داد، سطح بیان ژن E2F7 در مراحل پیشرفته، بیشتر از مراحل ابتدایی است [24]. علاوه‌براین نشان داده شده است بیان E2F7 به‌طور قابل‌توجهی با مراحل تومور و بقای کلی بیماران مبتلابه سرطان روده بزرگ مرتبط است و درنتیجه این ژن ممکن است به‌عنوان هدف درمانی بالقوه برای سرطان روده بزرگ عمل کند [25]. نتایج مطالعه صورت‌گرفته بر سرطان کولورکتال در سال 2021 نشان داد E2F7 پایداری MAPK را برای افزایش و تکثیر سلولی، تهاجم و مهاجرت در سرطان روده بزرگ را ارتقا داد [26]. ازطرفی به‌طور مشابه، مطالعه دیگری، ارتباط مسیر سیگنالینگ MAPK را با رشد سرطان روده بزرگ در داخل بدن نشان داده است [27]. همچنین مشخص شده است MAPK فعالیت سلول‌های بنیادی تومور سرطان روده را ارتقا می‌دهد [28]. مطالعات قبلی، نقش مهاری E2F7 را در بیان ژنهای پایین‌دست آن گزارش کرده است [29]. علاوه‌براین، miR-199b-5p در سرطان کولورکتال بیان کمی دارد [30]. نتایج تشخیص تراشه نشان داد پس از خاموش کردن E2F7، اتصال E2F7 به پروموتر miR-199b کاهش یافت و درنتیجه بیانmiR-199b را تقویت کرد. به‌طور خلاصه، E2F7 بیان miR-199b را با اتصال به پروموتر miR-199b در سرطان کولورکتال کاهش می‌دهد [26]. ازین‌رو ارزیابی سطح بیان این ژن در مراحل اولیه نسبت به مراحل پیشرفته و بررسی پتانسیل تشخیصی وابسته به سطح بیان در مراحل ابتدایی ممکن است در بهبود روند درمان و تشخیص بیماران مبتلابه سرطان کولورکتال مؤثر باشد.
نتیجه‌گیری
یافته‌های این مطالعه نشان داد ژنهای PBK و E2F7 در مراحل ابتدایی نسبت به مراحل پیشرفته، سطح بیان بیشتری دارند. این نتایج پیشنهاد می‌کنند ژنهای PBK و E2F7 پتانسیل به‌کارگیری به‌عنوان مارکرهای زیستی را در مراحل ابتدایی دارند، اگرچه مطالعات بیشتری برای تأیید این یافته‌ها نیاز است. علاوه‌براین سطح بیان ژنهای کاندید در مراحل ابتدایی به‌خوبی از مراحل پیشرفته قابل‌تمایز و تفکیک است. ازین‌رو مطالعات مولکولی بیشتری نیز برای ارائه تصویری عمیق‌تر در مورد عملکرد PBK و E2F7 در سرطان کولورکتال لازم است.
از محدودیت‌های این مطالعه می‌توان به دسترسی بسیار کم به نمونه‌های توموری در مراحل پیشرفته و همچنین ممکن نبودن پیگیری روند پیشرفت بیماری در نمونه‌های جمع‌آوری‌شده، اشاره کرد. پیشنهاد می‌شود ژنهای بیشتری برای معرفی بیومارکر در جهت جداسازی دو جمعیت توموری در مراحل اولیه و پیشرفته بررسی شوند. همچنین در مدل‌های سلولی سرطان کلورکتال، به عملکرد این ژن‌ها در جهت تأیید نقش آن‌ها در روند پیشرفت بیماری پرداخته شود.
ملاحظات اخلاقی
پیروی از اصول اخلاق پژوهش
این پژوهش در کمیته اخلاق دانشگاه آزاد شهرکرد با کد IR.IAU.SHK.REC.1399.022 به تصویب رسیده است.
حامی مالی
این مقاله برگرفته از پایان‌نامه دکتری تخصصی گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی است و با حمایت معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه آزاد شهرکرد انجام شده است.
مشارکت نویسندگان
طراحی و مفهوم‌سازی مطالعه و روش‌شناسی: رضا هاشمی و مریم پیمانی؛ داده کاوی، تجزیهوتحلیل رسمی و بررسی: رضا هاشمی؛ نظارت، اعتبار سنجی، تجسم و تأیید نهایی: مریم پیمانی و کامران قائدی؛ تفسیر اطلاعات به‌دست‌آمده: مریم پیمانی؛: جمع‌آوری نمونه: هانا صفار؛ نگارش مقاله، بازنگری و ویرایش: رضا هاشمی؛ همه نویسندگان نسخه نهایی را خواندند و تأیید کردند
تعارض منافع
بنابر اظهار نویسندگان، این مقاله تعارض منافع ندارد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان از تمام افرادی که در جمع‌آوری نمونه‌های خون در این پژوهش یاری رساندند، تشکر و قدردانی می‌کنند.
References
1.Bray F, Laversanne M, Weiderpass E, Soerjomataram I. The ever-increasing importance of cancer as a leading cause of premature death worldwide. Cancer. 2021; 127(16):3029-30. [DOI:10.1002/cncr.33587] [PMID]
2.Lao VV, Grady WM. Epigenetics and colorectal cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011; 8(12):686-700. [DOI:10.1038/nrgastro.2011.173] [PMID] [PMCID]
3.Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021; 71(3):209-49. [DOI:10.3322/caac.21660] [PMID]
4.Koncina E, Haan S, Rauh S, Letellier E. Prognostic and predictive molecular biomarkers for colorectal cancer: Updates and challenges. Cancers. 2020; 12(2):319. [DOI:10.3390/cancers12020319] [PMID] [PMCID]
5.Freeman HJ. Early stage colon cancer. World J Gastroenterol. 2013; 19(46):8468-73. [DOI:10.3748/wjg.v19.i46.8468] [PMID] [PMCID]
6.Xi Y, Xu P. Global colorectal cancer burden in 2020 and projections to 2040. Transl Oncol. 2021; 14(10):101174. [DOI:10.1016/j.tranon.2021.101174] [PMID] [PMCID]
7.Sreekumar R, Harris S, Moutasim K, DeMateos R, Patel A, Emo K, et al. Assessment of nuclear ZEB2 as a biomarker for colorectal cancer outcome and TNM risk stratification. JAMA Netw Open. 2018; 1(6):e183115. [DOI:10.1001/jamanetworkopen.2018.3115] [PMID] [PMCID]
8.Liu H, Xu Y, Zhang Q, Yang H, Shi W, Liu Z, et al. Prognostic significance of TBL1XR1 in predicting liver metastasis for early stage colorectal cancer. Surg Oncol. 2017; 26(1):13-20. [DOI:10.1016/j.suronc.2016.12.003] [PMID]
9.Joel M, Mughal AA, Grieg Z, Murrell W, Palmero S, Mikkelsen B, et al. Targeting PBK/TOPK decreases growth and survival of glioma initiating cells in vitro and attenuates tumor growth in vivo. Mol Cancer. 2015; 14:121. [DOI:10.1186/s12943-015-0398-x] [PMID] [PMCID]
10.Ayllon V, O’connor R. PBK/TOPK promotes tumour cell proliferation through p38 MAPK activity and regulation of the DNA damage response. Oncogene. 2007; 26(24):3451-61. [DOI:10.1038/sj.onc.1210142] [PMID]
11.Carvajal LA, Hamard P-J, Tonnessen C, Manfredi JJ. E2F7, a novel target, is up-regulated by p53 and mediates DNA damage-dependent transcriptional repression. Genes Dev. 2012; 26(14):1533-45. [DOI:10.1101/gad.184911.111] [PMID] [PMCID]
12.Johnson DG, DeGregori J. Putting the oncogenic and tumor suppressive activities of E2F into context. Curr Mol Med. 2006; 6(7):731-8. [DOI:10.2174/1566524010606070731]
13.Bahmani L, Baghi M, Peymani M, Javeri A, Ghaedi K. MiR-141-3p and miR-200a-3p are involved in Th17 cell differentiation by negatively regulating RARB expression. Hum Cell. 2021; 34(5):1375-87. [DOI:10.1007/s13577-021-00558-4] [PMID]
14.Kwon CH, Park HJ, Choi YR, Kim A, Kim HW, Choi JH, et al. PSMB8 and PBK as potential gastric cancer subtype-specific biomarkers associated with prognosis. Oncotarget. 2016; 7(16):21454-8. [DOI:10.18632/oncotarget.7411] [PMID] [PMCID]
15.Abe Y, Takeuchi T, Kagawa-Miki L, Ueda N, Shigemoto K, Yasukawa M, et al. A mitotic kinase TOPK enhances Cdk1/cyclin B1-dependent phosphorylation of PRC1 and promotes cytokinesis. J Mol Biol. 2007; 370(2):231-45. [DOI:10.1016/j.jmb.2007.04.067] [PMID]
16.Chen T-C, Lee S-A, Hong T-M, Shih J-Y, Lai J-M, Chiou H-Y, et al. From midbody protein− protein interaction network construction to novel regulators in cytokinesis. Proteome Res. 2009; 8(11):4943-53. [DOI:10.1021/pr900325f] [PMID]
17.He F, Yan Q, Fan L, Liu Y, Cui J, Wang J, et al. PBK/TOPK in the differential diagnosis of cholangiocarcinoma from hepatocellular carcinoma and its involvement in prognosis of human cholangiocarcinoma. Hum Pathol. 2010; 41(3):415-24. [DOI:10.1016/j.humpath.2009.05.016] [PMID]
18.Su T-C, Chen C-Y, Tsai W-C, Hsu H-T, Yen H-H, Sung W-W, et al. Cytoplasmic, nuclear, and total PBK/TOPK expression is associated with prognosis in colorectal cancer patients: A retrospective analysis based on immunohistochemistry stain of tissue microarrays. Plos One. 2018; 13(10):e0204866. [DOI:10.1371/journal.pone.0204866] [PMID] [PMCID]
19.Hu F, Gartenhaus R, Eichberg D, Liu Z, Fang H, Rapoport A. PBK/TOPK interacts with the DBD domain of tumor suppressor p53 and modulates expression of transcriptional targets including p21. Oncogene. 2010; 29(40):5464-74. [DOI:10.1038/onc.2010.275] [PMID]
20.Nagano-Matsuo A, Inoue S, Koshino A, Ota A, Nakao K, Komura M, et al. PBK expression predicts favorable survival in colorectal cancer patients. Virchows Arch. 2021; 479(2):277-84. [DOI:10.1007/s00428-021-03062-0] [PMID]
21.Endo-Munoz L, Dahler A, Teakle N, Rickwood D, Hazar-Rethinam M, Abdul-Jabbar I, et al. E2F7 can regulate proliferation, differentiation, and apoptotic responses in human keratinocytes: Implications for cutaneous squamous cell carcinoma formation. Cancer Res. 2009; 69(5):1800-8. [DOI:10.1158/0008-5472.CAN-08-2725] [PMID]
22.Wang Y, Pei X, Xu P, Tan Z, Zhu Z, Zhang G, et al. E2F7, regulated by miR30c, inhibits apoptosis and promotes cell cycle of prostate cancer cells. Oncol Rep. 2020; 44(3):849-62. [DOI:10.3892/or.2020.7682] [PMID] [PMCID]
23.Cheng C, Guo L, Ma Y, Wang Z, Fan X, Shan Z. Up-regulation of mir-26a-5p inhibits E2F7 to regulate the progression of renal carcinoma cells. Cancer Manag Res. 2020; 12:11723-33. [DOI:10.2147/CMAR.S271710] [PMID] [PMCID]
24.Yin W, Wang B, Ding M, Huo Y, Hu H, Cai R, et al. Elevated E2F7 expression predicts poor prognosis in human patients with gliomas. J Clin Neurosci. 2016; 33:187-93. [DOI:10.1016/j.jocn.2016.04.019] [PMID]
25.Yao H, Lu F, Shao Y. The E2F family as potential biomarkers and therapeutic targets in colon cancer. PeerJ. 2020; 8:e8562. [DOI:10.7717/peerj.8562] [PMID] [PMCID]
26.Guo X, Liu L, Zhang Q, Yang W, Zhang Y. E2F7 transcriptionally inhibits MicroRNA-199b expression to promote USP47, thereby enhancing colon cancer tumor stem cell activity and promoting the occurrence of colon cancer. Front Oncol. 2021; 10:565449. [DOI:10.3389/fonc.2020.565449] [PMID] [PMCID]
27.Zhang S-L, Zhu H-Y, Zhou B-Y, Chu Y, Huo J-R, Tan Y-Y, et al. Histone deacetylase 6 is overexpressed and promotes tumor growth of colon cancer through regulation of the MAPK/ERK signal pathway. Onco Targets Ther. 2019; 12:2409-19. [DOI:10.2147/OTT.S194986] [PMID] [PMCID]
28.Vishnubalaji R, Manikandan M, Fahad M, Hamam R, Alfayez M, Kassem M, et al. Molecular profiling of ALDH1+ colorectal cancer stem cells reveals preferential activation of MAPK, FAK, and oxidative stress pro-survival signalling pathways. Oncotarget. 2018; 9(17):13551-84. [DOI:10.18632/oncotarget.24420] [PMID] [PMCID]
29.Mitxelena J, Apraiz A, Vallejo-Rodríguez J, García-Santisteban I, Fullaondo A, Alvarez-Fernández M, et al. An E2F7-dependent transcriptional program modulates DNA damage repair and genomic stability. Nucleic Acids Res. 2018; 46(9):4546-59. [DOI:10.1093/nar/gky218] [PMID] [PMCID]
30.Shen Z-l, Wang B, Jiang K-w, Ye C-x, Cheng C, Yan Y-c, et al. Downregulation of miR-199b is associated with distant metastasis in colorectal cancer via activation of SIRT1 and inhibition of CREB/KISS1 signaling. Oncotarget. 2016; 7(23):35092. [DOI:10.18632/oncotarget.9042] [PMID] [PMCID]
2.Lao VV, Grady WM. Epigenetics and colorectal cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011; 8(12):686-700. [DOI:10.1038/nrgastro.2011.173] [PMID] [PMCID]
3.Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021; 71(3):209-49. [DOI:10.3322/caac.21660] [PMID]
4.Koncina E, Haan S, Rauh S, Letellier E. Prognostic and predictive molecular biomarkers for colorectal cancer: Updates and challenges. Cancers. 2020; 12(2):319. [DOI:10.3390/cancers12020319] [PMID] [PMCID]
5.Freeman HJ. Early stage colon cancer. World J Gastroenterol. 2013; 19(46):8468-73. [DOI:10.3748/wjg.v19.i46.8468] [PMID] [PMCID]
6.Xi Y, Xu P. Global colorectal cancer burden in 2020 and projections to 2040. Transl Oncol. 2021; 14(10):101174. [DOI:10.1016/j.tranon.2021.101174] [PMID] [PMCID]
7.Sreekumar R, Harris S, Moutasim K, DeMateos R, Patel A, Emo K, et al. Assessment of nuclear ZEB2 as a biomarker for colorectal cancer outcome and TNM risk stratification. JAMA Netw Open. 2018; 1(6):e183115. [DOI:10.1001/jamanetworkopen.2018.3115] [PMID] [PMCID]
8.Liu H, Xu Y, Zhang Q, Yang H, Shi W, Liu Z, et al. Prognostic significance of TBL1XR1 in predicting liver metastasis for early stage colorectal cancer. Surg Oncol. 2017; 26(1):13-20. [DOI:10.1016/j.suronc.2016.12.003] [PMID]
9.Joel M, Mughal AA, Grieg Z, Murrell W, Palmero S, Mikkelsen B, et al. Targeting PBK/TOPK decreases growth and survival of glioma initiating cells in vitro and attenuates tumor growth in vivo. Mol Cancer. 2015; 14:121. [DOI:10.1186/s12943-015-0398-x] [PMID] [PMCID]
10.Ayllon V, O’connor R. PBK/TOPK promotes tumour cell proliferation through p38 MAPK activity and regulation of the DNA damage response. Oncogene. 2007; 26(24):3451-61. [DOI:10.1038/sj.onc.1210142] [PMID]
11.Carvajal LA, Hamard P-J, Tonnessen C, Manfredi JJ. E2F7, a novel target, is up-regulated by p53 and mediates DNA damage-dependent transcriptional repression. Genes Dev. 2012; 26(14):1533-45. [DOI:10.1101/gad.184911.111] [PMID] [PMCID]
12.Johnson DG, DeGregori J. Putting the oncogenic and tumor suppressive activities of E2F into context. Curr Mol Med. 2006; 6(7):731-8. [DOI:10.2174/1566524010606070731]
13.Bahmani L, Baghi M, Peymani M, Javeri A, Ghaedi K. MiR-141-3p and miR-200a-3p are involved in Th17 cell differentiation by negatively regulating RARB expression. Hum Cell. 2021; 34(5):1375-87. [DOI:10.1007/s13577-021-00558-4] [PMID]
14.Kwon CH, Park HJ, Choi YR, Kim A, Kim HW, Choi JH, et al. PSMB8 and PBK as potential gastric cancer subtype-specific biomarkers associated with prognosis. Oncotarget. 2016; 7(16):21454-8. [DOI:10.18632/oncotarget.7411] [PMID] [PMCID]
15.Abe Y, Takeuchi T, Kagawa-Miki L, Ueda N, Shigemoto K, Yasukawa M, et al. A mitotic kinase TOPK enhances Cdk1/cyclin B1-dependent phosphorylation of PRC1 and promotes cytokinesis. J Mol Biol. 2007; 370(2):231-45. [DOI:10.1016/j.jmb.2007.04.067] [PMID]
16.Chen T-C, Lee S-A, Hong T-M, Shih J-Y, Lai J-M, Chiou H-Y, et al. From midbody protein− protein interaction network construction to novel regulators in cytokinesis. Proteome Res. 2009; 8(11):4943-53. [DOI:10.1021/pr900325f] [PMID]
17.He F, Yan Q, Fan L, Liu Y, Cui J, Wang J, et al. PBK/TOPK in the differential diagnosis of cholangiocarcinoma from hepatocellular carcinoma and its involvement in prognosis of human cholangiocarcinoma. Hum Pathol. 2010; 41(3):415-24. [DOI:10.1016/j.humpath.2009.05.016] [PMID]
18.Su T-C, Chen C-Y, Tsai W-C, Hsu H-T, Yen H-H, Sung W-W, et al. Cytoplasmic, nuclear, and total PBK/TOPK expression is associated with prognosis in colorectal cancer patients: A retrospective analysis based on immunohistochemistry stain of tissue microarrays. Plos One. 2018; 13(10):e0204866. [DOI:10.1371/journal.pone.0204866] [PMID] [PMCID]
19.Hu F, Gartenhaus R, Eichberg D, Liu Z, Fang H, Rapoport A. PBK/TOPK interacts with the DBD domain of tumor suppressor p53 and modulates expression of transcriptional targets including p21. Oncogene. 2010; 29(40):5464-74. [DOI:10.1038/onc.2010.275] [PMID]
20.Nagano-Matsuo A, Inoue S, Koshino A, Ota A, Nakao K, Komura M, et al. PBK expression predicts favorable survival in colorectal cancer patients. Virchows Arch. 2021; 479(2):277-84. [DOI:10.1007/s00428-021-03062-0] [PMID]
21.Endo-Munoz L, Dahler A, Teakle N, Rickwood D, Hazar-Rethinam M, Abdul-Jabbar I, et al. E2F7 can regulate proliferation, differentiation, and apoptotic responses in human keratinocytes: Implications for cutaneous squamous cell carcinoma formation. Cancer Res. 2009; 69(5):1800-8. [DOI:10.1158/0008-5472.CAN-08-2725] [PMID]
22.Wang Y, Pei X, Xu P, Tan Z, Zhu Z, Zhang G, et al. E2F7, regulated by miR30c, inhibits apoptosis and promotes cell cycle of prostate cancer cells. Oncol Rep. 2020; 44(3):849-62. [DOI:10.3892/or.2020.7682] [PMID] [PMCID]
23.Cheng C, Guo L, Ma Y, Wang Z, Fan X, Shan Z. Up-regulation of mir-26a-5p inhibits E2F7 to regulate the progression of renal carcinoma cells. Cancer Manag Res. 2020; 12:11723-33. [DOI:10.2147/CMAR.S271710] [PMID] [PMCID]
24.Yin W, Wang B, Ding M, Huo Y, Hu H, Cai R, et al. Elevated E2F7 expression predicts poor prognosis in human patients with gliomas. J Clin Neurosci. 2016; 33:187-93. [DOI:10.1016/j.jocn.2016.04.019] [PMID]
25.Yao H, Lu F, Shao Y. The E2F family as potential biomarkers and therapeutic targets in colon cancer. PeerJ. 2020; 8:e8562. [DOI:10.7717/peerj.8562] [PMID] [PMCID]
26.Guo X, Liu L, Zhang Q, Yang W, Zhang Y. E2F7 transcriptionally inhibits MicroRNA-199b expression to promote USP47, thereby enhancing colon cancer tumor stem cell activity and promoting the occurrence of colon cancer. Front Oncol. 2021; 10:565449. [DOI:10.3389/fonc.2020.565449] [PMID] [PMCID]
27.Zhang S-L, Zhu H-Y, Zhou B-Y, Chu Y, Huo J-R, Tan Y-Y, et al. Histone deacetylase 6 is overexpressed and promotes tumor growth of colon cancer through regulation of the MAPK/ERK signal pathway. Onco Targets Ther. 2019; 12:2409-19. [DOI:10.2147/OTT.S194986] [PMID] [PMCID]
28.Vishnubalaji R, Manikandan M, Fahad M, Hamam R, Alfayez M, Kassem M, et al. Molecular profiling of ALDH1+ colorectal cancer stem cells reveals preferential activation of MAPK, FAK, and oxidative stress pro-survival signalling pathways. Oncotarget. 2018; 9(17):13551-84. [DOI:10.18632/oncotarget.24420] [PMID] [PMCID]
29.Mitxelena J, Apraiz A, Vallejo-Rodríguez J, García-Santisteban I, Fullaondo A, Alvarez-Fernández M, et al. An E2F7-dependent transcriptional program modulates DNA damage repair and genomic stability. Nucleic Acids Res. 2018; 46(9):4546-59. [DOI:10.1093/nar/gky218] [PMID] [PMCID]
30.Shen Z-l, Wang B, Jiang K-w, Ye C-x, Cheng C, Yan Y-c, et al. Downregulation of miR-199b is associated with distant metastasis in colorectal cancer via activation of SIRT1 and inhibition of CREB/KISS1 signaling. Oncotarget. 2016; 7(23):35092. [DOI:10.18632/oncotarget.9042] [PMID] [PMCID]
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
