fa طراحی، ساخت، بیان و تخلیص ژن کدکننده پروتئین کایمر CfaE, CotD از باکتری Enterotoxigenic Escherichia coli علوم پایه Basic Sciences پژوهشي اصیل Original Atricle <div style="text-align: justify;"><strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">زمینه و هدف</span></span></strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">:</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> اشرشیاکلی انتروتوکسیژنیک (</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">ETEC</span></span><span style="font-family:b nazanin;">) یکی از رایج‌ترین علل باکتریایی مرگ و میر ناشی از اسهال در کودکان و مسافران کشورهای در ‌حال توسعه می‌باشد.</span> <span style="font-family:b nazanin;">فاکتورهای کلونیزاسیون </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">&nbsp;ETEC</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> مانند </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">CFA / I</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> و </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">CS2</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> نقش مهمی در ایجاد بیماری دارند</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">.</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> در این مطالعه</span> <span style="font-family:b nazanin;">برای ساخت پروتئین نوترکیب از همجوش زیرواحد راسی </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">CFA / I</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> (</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">CfaE</span></span><span style="font-family:b nazanin;">) و زیر واحد ساختاری </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">CS2</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> (</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">CotD</span></span><span style="font-family:b nazanin;">) از </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">ETEC</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> استفاده شده است. از آن</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">‌</span></span><span style="font-family:b nazanin;">جایی که پاسخ‌های ایمنی مخاطی روده علیه </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">CF</span></span><span style="font-family:b nazanin;">‌‌‌ها می‌تواند مانع از ایجاد بیماری شود، مطالعه</span> <span style="font-family:b nazanin;">حاضر</span> <span style="font-family:b nazanin;">با</span> <span style="font-family:b nazanin;">هدف تولید آنتی‌ژن کایمریک به جهت ساخت واکسن موثر علیه باکتری </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">ETEC</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> انجام شد.</span><br> <strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">مواد</span></span></strong> <strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">و</span></span></strong> <strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">روش</span></span></strong><strong><span dir="LTR"><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:times new roman,serif;">‌</span></span></span></strong><strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">ها</span></span></strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">:</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> به منظور تکثیر ژن </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">cfae</span></span><span style="font-family:b nazanin;">-</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">cotd</span></span><span style="font-family:b nazanin;">، از ساختار ژنی دوگانه متشکل از </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">cfae</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> و </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">cotd</span></span><span style="font-family:b nazanin;">، واکنش </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">PCR</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> توسط پرایمرهای طراحی</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">‌</span></span><span style="font-family:b nazanin;">شده انجام شد. ژن تکثیر شده در وکتور بیانی </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">pET28a</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> همسانه</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">‌</span></span><span style="font-family:b nazanin;">سازی شد. در پی القای سازه ژنی نوترکیب با ماده‌ی </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">IPTG</span></span><span style="font-family:b nazanin;">، پروتئین نوترکیب بیان و با ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی، خالص</span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">‌</span></span><span style="font-family:b nazanin;">سازی و به وسیله وسترن بلاتینگ توسط </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">Anti-Histag</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> تایید شد.</span><br> <strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">ملاحظات اخلاقی: </span></span></strong><a name="_Hlk6135280"><span style="font-family:b nazanin;">این مطالعه با کد </span></a><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">IR.IAU.SRB.REC.1397.066</span></span><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:12.0pt;"> در کمیته اخلاق پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران به تصویب رسیده است. </span></span><br> <strong><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;">یافته‌ها</span></span></strong><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">:</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> صحت همسانه سازی با استفاده از کلونی </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">PCR</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> و واکنش هضم آنزیمی تایید شد. حضور</span> <span style="font-family:b nazanin;">باند</span> <span style="font-family:b nazanin;">در</span> <span style="font-family:b nazanin;">ژل </span><span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">SDS-PAGE </span></span>&nbsp;<span dir="LTR"><span style="font-family:times new roman,serif;">10%</span></span><span style="font-family:b nazanin;"> در محدوده‌ی 68 کیلو دالتونی، بیان پروتئین نوترکیب و هم‌چنین حضور باند بر کاغذ نیتروسلولز در محدوده مذکور در آزمون وسترن بلاتینگ، تاییدی بر تولید پروتئین نوترکیب بود.</span><br> <strong><span dir="RTL"><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">نتیجه</span></span></span></span><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:11.0pt;">‌</span></span></span><span dir="RTL"><span style="color:#12336E;"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">گیری:</span></span></span></span></strong><span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;"> بهینه</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">سازی</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">کدون</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">و</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">بیان</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">در</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">میزبان‌‌‌های</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">هترولوگ</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">یک</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">روش</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">مفید</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">در</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">تولید</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">پروتئین</span></span></span><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:11.0pt;">‌</span></span><span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">های</span></span></span> <span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;">نوترکیب است. هم‌چنین تولید آنتی ژن‌‌های </span></span></span><span style="font-family:times new roman,serif;"><span style="font-size:11.0pt;">ETEC</span></span><span dir="RTL"><span style="font-family:b nazanin;"><span style="font-size:11.0pt;"> به عنوان کاندید واکسیناسیون بر علیه این باکتری مطرح می‌باشد.</span></span></span></div> <div style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><strong>Background and Aim:</strong> Enterotoxigenic <em>Escherichia coli</em> (ETEC) is one of the most common bacterial causes of diarrhea deaths among children and travelers in developing countries<span dir="RTL">.</span> The ETEC colonization factors, such as CFA/I and CS2 play an important role in the development of the disease. In this study, to produce the CFaE fusion recombinant protein, the tip subunits CFA/I(CfaE) and sub structural unit of CS2 (CotD) from ETEC, were used. Since mucosal immune responses to CFs can prevent disease, the aim of this study was to develop a chimeric antigen for developing the effective vaccine.<br> <strong>Materials and Methods:</strong> In order to amplify the cfae-cotd gene, a dual gene construct consisting of cfae and cotd, the PCR reaction was performed by designed primers. The propagated gene was cloned in the expression vector pET28a. Following the induction of a recombinant gene construct with IPTG, the recombinant protein was expressed and purified by Ni-NTA chromatography column and confirmed by western blotting by Anti-Histag.<br> <strong>Ethical Considerations:</strong> <a name="_Hlk6135252">This study with research ethics code IR.IAU.SRB.REC.1397.066 has been approved by research ethics committee at Islamic Azad University, Science and Research Branch of Tehran, Iran.</a><br> <strong>Findings:</strong> Cloning accuracy was confirmed by PCR and enzyme digestion reaction. The presence of the band in the SDS-PAGE 10% gel in the 68 kDa region, the expression of the recombinant protein, and the presence of the band on the nitrocellulose paper in the Western blotting test confirmed the production of recombinant protein.<br> <strong>Conclusion:</strong> Optimization of codon and expression in heterologous hosts is a useful method for the production of recombinant proteins. The production of ETEC antigens as a candidate for vaccination against this bacterium is also prominent.</span></div> پروتئین نوترکیب, CfaE, Enterotoxigenic Escherichia coli, Fimbriae proteins CfaE , Enterotoxigenic Escherichia coli, Fimbriae proteins, Recombinant protein 96 107 http://jams.arakmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-3888-2&slc_lang=fa&sid=1 Pooneh Roghanian پونه روغنیان poonehroghanian13@gmail.com 4600319475328460066507 4600319475328460066507 No Department of Genetics, Faculty of Basic Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، واحد علوم تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران. Jafar Amani جعفر امانی jafar.amani@gmail.com 4600319475328460066508 4600319475328460066508 Yes Applied Microbiology Research Center, Systems Biology and Poisonings Institute, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات میکروبیولوژی کاربردی، انستیتو سیستم بیولوژی و مسمومیت‌ها، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله (عج)، تهران، ایران. Shoreh Zare شهره زارع shohrehzare@yahoo.com 4600319475328460066509 4600319475328460066509 No Department of Genetics and Biotechnology, School of Biological Science, Varamin-Pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin, Iran. گروه ژنتیک و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، ورامین، ایران. Zahra Nour Mohammadi زهرا نورمحمدی genetics1392@gmail.com 4600319475328460066510 4600319475328460066510 No Department of Genetics, Faculty of Basic Sciences, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. گروه ژنتیک، دانشکده علوم پایه، واحد علوم تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران.