دوره 29، شماره 1 - ( 1-1405 )
جلد 29 شماره 1 صفحات 25-19 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Faghihi F, Amani J, Gholami M, salahshourifar I. Construction and Cloning of CRISPR /Cas9 Target Gene and Confirmation of Cell Line Identity by QF - PCR. J Arak Uni Med Sci 2026; 29 (1) :19-25
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-8269-fa.html
URL: http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-8269-fa.html
فقیهی فاطمه، امانی هارونی جعفر، غلامی میلاد، سلحشوری فر ایمان. ساخت و کلونینگ وکتور CRISPR/Cas9 هدفمند ژن CDKL5 و تأیید هویت خط سلولی با روش QF-PCR. مجله دانشگاه علوم پزشكي اراك. 1405; 29 (1) :19-25
1- دانشجوی دکتری، گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2- انستیتو فناوریهای پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران ،jafar.amani@gmail.com
3- گروه بیوشیمی و ژنتیک، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اراک، اراک، ایران
4- گروه زیستشناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2- انستیتو فناوریهای پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی بقیه الله، تهران، ایران ،
3- گروه بیوشیمی و ژنتیک، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اراک، اراک، ایران
4- گروه زیستشناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
چکیده: (630 مشاهده)
مقدمه: اختلال طیف اوتیسم (Autism Spectrum Disorder) ASD و اختلال کمبود CDKL5 از جمله اختلالات عصبی- رشدی با ریشه ژنتیکی هستند که نیازمند مدلهای دقیق مولکولی برای مطالعه مکانیسمهای بیماری و توسعه درمانهای نوین میباشند. سیستم ویرایش ژنوم CRISPR/Cas9 ابزاری کارآمد برای ایجاد تغییرات هدفمند در ژنوم است. هدف این مطالعه، طراحی و ساخت وکتور CRISPR/Cas9 حامل sgRNA اختصاصی برای ژن CDKL5و تأیید کلونینگ و هویت خط سلولی مورد استفاده به کمک روشهای مولکولی بود.
روش کار: در این مطالعه تجربی، ابتدا sgRNA اختصاصی برای ناحیه مورد نظر در ژن CDKL5 طراحی شد. الیگوهای Forward و Reverse آنیل شده و در وکتور PX458 کلون شدند. پس از ترانسفورماسیون باکتری E. coli سویه DH5α، کلونیهای مثبت به روش Colony PCR و توالییابی تأیید شدند. همچنین جهت اطمینان از هویت خط سلولی HEK293T مورد استفاده، آزمون QF-PCR برای تعیین جنسیت و بررسی کروموزومی انجام شد.
یافتهها: نتایج Colony PCR وجود باند مورد انتظار 230 جفت بازی را در کلونیهای منتخب نشان داد. توالییابی نیز Insert صحیح sgRNA را در وکتور تأیید کرد. نتایج QF-PCRالگوهای پیکهای مشخص برای کروموزومهای جنسی را نشان داد که هویت خط سلولی را تأیید میکرد.
نتیجهگیری: ساخت وکتور CRISPR/Cas9هدفمند ژن CDKL5با موفقیت انجام شد و تأییدیههای مولکولی لازم شامل کلونینگ و بررسی خط سلولی حاصل گردید. این وکتور میتواند برای مطالعات بعدی ویرایش ژن در مدلهای سلولی مورد استفاده قرار گیرد.
روش کار: در این مطالعه تجربی، ابتدا sgRNA اختصاصی برای ناحیه مورد نظر در ژن CDKL5 طراحی شد. الیگوهای Forward و Reverse آنیل شده و در وکتور PX458 کلون شدند. پس از ترانسفورماسیون باکتری E. coli سویه DH5α، کلونیهای مثبت به روش Colony PCR و توالییابی تأیید شدند. همچنین جهت اطمینان از هویت خط سلولی HEK293T مورد استفاده، آزمون QF-PCR برای تعیین جنسیت و بررسی کروموزومی انجام شد.
یافتهها: نتایج Colony PCR وجود باند مورد انتظار 230 جفت بازی را در کلونیهای منتخب نشان داد. توالییابی نیز Insert صحیح sgRNA را در وکتور تأیید کرد. نتایج QF-PCRالگوهای پیکهای مشخص برای کروموزومهای جنسی را نشان داد که هویت خط سلولی را تأیید میکرد.
نتیجهگیری: ساخت وکتور CRISPR/Cas9هدفمند ژن CDKL5با موفقیت انجام شد و تأییدیههای مولکولی لازم شامل کلونینگ و بررسی خط سلولی حاصل گردید. این وکتور میتواند برای مطالعات بعدی ویرایش ژن در مدلهای سلولی مورد استفاده قرار گیرد.
واژههای کلیدی: CRISPR/Cas9،
ژن CDKL5،
کلونینگ،
QF-PCR،
خط سلولی HEK293T
فهرست منابع
1. Lord C, Elsabbagh M, Baird G, Veenstra-Vanderweele J. Autism spectrum disorder. The Lancet. 2018;392(10146):508-20. pmid: 30078460 doi: 10.1016/S0140-6736(18)31129-2
2. Faja S, Dawson G. Autism spectrum disorder. In: Beauchaine TP, Hinshaw SP, editors. Child and Adolescent Psychopathology. 3rd ed. New York: Guilford Press; 2018. doi:10.1002/9781394258932.ch22
3. Lord C, Brugha TS, Charman T, Cusack J, Dumas G, Frazier T, et al. Autism spectrum disorder. Nat Rev Dis Primers. 2020;6(1):5. pmid: 3194916 doi: 10.1038/s41572-019-0138-4
4. Grove J, Ripke S, Als TD, Mattheisen M, Walters RK, Won H, et al. Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder. Nat Genet. 2019; 51(3):431-44. pmid: 30804558 doi: 10.1038/s41588-019-0344-8
5. Campisi L, Imran N, Nazeer A, Skokauskas N, Waqar Azeem M. Autism spectrum disorder. Br Med Bull. 2018; 127(1):91-100. pmid: 30215678 doi: 10.1093/bmb/ldy026
6. Hirota T, King BH. Autism spectrum disorder: A review. JAMA. 2023;329(2):157-68. pmid: 36625807 doi: 10.1001/jama.2022.23661
7. Ramaswami G, Geschwind DH. Genetics of autism spectrum disorder. Handb Clin Neurol. 2018; 147:321-29. pmid: 29325621 doi: 10.1016/B978-0-444-63233-3.00021-X
8. Goldstein S, Ozonoff S. Assessment of autism spectrum disorder. New York: The Guilford Press; 2018.
9. Woodbury-Smith M, Scherer SW. Progress in the genetics of autism spectrum disorder. Dev Med Child Neurol. 2018;60(5):445-51. pmid: 29574884 doi: 10.1111/dmcn.13717
10. Zwaigenbaum L, Penner M. Autism spectrum disorder: advances in diagnosis and evaluation. BMJ. 2018;361:k1674. pmid: 29784657 doi: 10.1136/bmj.k1674
11. Guang S, Pang N, Deng X, Yang L, He F, Wue L, et al. Synaptopathology involved in autism spectrum disorder. Front Cell Neurosci. 2018;12:470. pmid: 30627085 doi: 10.3389/fncel.2018.00470
12. Hodges H, Fealko C, Soares N. Autism spectrum disorder: definition, epidemiology, causes, and clinical evaluation. Transl Pediatr. 2020;9(Suppl 1):S55–S65. pmid: 32206584 doi: 10.21037/tp.2019.09.09
13. Masi A, DeMayo MM, Glozier N, Guastella AJ. An overview of autism spectrum disorder, heterogeneity and treatment options. Neurosci Bull. 2017;33(2):183-93. pmid: 28213805 doi: 10.1007/s12264-017-0100-y
14. Rylaarsdam L, Guemez-Gamboa A. Genetic causes and modifiers of autism spectrum disorder. Front Cell Neurosci. 2019;13:385. pmid: 31481879 doi: 10.3389/fncel.2019.00385
15. Havdahl A, Niarchou M, Starnawska A, Uddin M, van der Merwe C, Warrier V. Genetic contributions to autism spectrum disorder. Psychol Med. 2021;51(13):2260-73. pmid: 33634770 doi: 10.1017/S0033291721000192
16. Manoli DS, State MW. Autism spectrum disorder genetics and the search for pathological mechanisms. Am J Psychiatry. 2021;178(1):30-8. pmid: 33384012 doi: 10.1176/appi.ajp.2020.20111608
17. Genovese A, Butler MG. Clinical assessment, genetics, and treatment approaches in autism spectrum disorder (ASD). Int J Mol Sci. 2020;21(13):4726. pmid: 32630718 doi: 10.3390/ijms21134726
18. Yoon SH, Choi J, Lee WJ, Do JT. Genetic and epigenetic etiology underlying autism spectrum disorder. J Clin Med. 2020;9(4):966. pmid: 32244359 doi: 10.3390/jcm9040966
19. Tang S, Terzic B, Wang I-TJ, Sarmiento N, Sizov K, Cui Y, et al. Altered NMDAR signaling underlies autistic-like features in mouse models of CDKL5 deficiency disorder. Nat Commun. 2019;10(1):265. pmid: 31201320 doi: 10.1038/s41467-019-10689-w
20. Erdogan M, Gumus H, Oztop DB, Balta B, Korkmaz Bayram K, Dündar M. Investigation of CDKL5 gene mutations in autistic patients accompanied with intractable seizures. Cumhuriyet Med J. 2020;44(2):165-71. doi:10.7197/cmj.1121531
21. Lyst MJ, Bird A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nat Rev Genet. 2015;16(5):261-75. pmid: 25732612 doi: 10.1038/nrg3897
22. Liyanage VR, Rastegar M. Rett syndrome and MeCP2. Neuromolecular Med. 2016;16(2):231–64. pmid: 24615633 doi: 10.1007/s12017-014-8295-9
23. Tokaji N, Ito H, Kohmoto T, et al. A rare male patient with classic Rett syndrome caused by MeCP2 mutation. Am J Med Genet A. 2018;176(3):699-702. pmid: 29341476 doi: 10.1002/ajmg.a.38595
24. Cobolli Gigli C, Scaramuzza L, De Simone M, Rossi RL, Pozzi D, Pagani M, et al. Lack of Methyl-CpG Binding Protein 2 (MeCP2) Affects Cell Fate Refinement During Embryonic Cortical Development. Cereb Cortex. 2018;28(5):1846-56. pmid: 29351579 doi: 10.1093/cercor/bhx360
25. Leonard H, Downs J, Benke TA, Swanson L, Olson H, Demarest S. CDKL5 deficiency disorder: clinical features, diagnosis, and management. Lancet Neurol. 2022;21(6):563-76. pmid: 35483386 doi: 10.1016/S1474-4422(22)00035-7
26. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 2013;8(11):2281-308. pmid: 24157548 doi: 10.1038/nprot.2013.143
27. Loi M, Trazzi S, Fuchs C, Galvani G, Medici G, Gennaccaro L, et al. Increased DNA damage and apoptosis in CDKL5-deficient neurons. Mol Neurobiol. 2020;57(5):2244-62. pmid: 32002787 doi: 10.1007/s12035-020-01884-8
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |
