مقدمه

اگرچه با اضافه کردن فلوراید شیوع پوسیدگی‌های دندان کاهش یافته است، اما هنوز گروه‌های بسیاری از جامعه مبتلا به پوسیدگی دندان هستند [1]. به طور طبیعی فلور دهان شامل گروه متنوعی از ارگانیسم‌ها بوده و دربرگیرنده باکتری‌ها، قارچ‌ها، میکوپلاسماها، تک‌یاخته‌ها و احتمالاً فلور ویروسی است. از این میان باکتری‌ها نسبت به سایر گروه‌ها غالب هستند و گونه‌های بسیار زیادی از آن‌ها کشت داده شده است [2]. شرایط مختلفی ازجمله شکل دندان‌ها، شیارها، نامرتب بودن دندان‌ها و کیفیت پایین ترمیم بر پوسیدگی دندان و ایجاد بیماری‌های پریودنتال اثر دارد [3]. بیماری‌های پریودنتال از شایع‌ترین بیماری‌های عفونی هستند [4] که از انواع مهم آن‌ها می‌توان به جینجیوایتیس، پریودنتیت، پریودنتیت مزمن، نکروزان و ایمپلنتایسیس اشاره کرد [5]. باکتری‌های دخیل در بیماری‌های پریودنتال عبارت‌اند از اکتینومایس‌ها، پروتلا اینترمدیا، پورفیروموناس ژنژیوالیس، آنتروباکتریاسه و غیره [6].

بیوفیلم به سلول‌هایی گفته می‌شود که روی یک سطح تثبیت شده و به وسیله یک ماتریکس از مواد پلیمری خارج سلولی با منشأ میکروبی احاطه شده‌اند [7]. ایجاد بیوفیلم باعث مقاومت باکتری در برابر عوامل ضدمیکروبی می‌شود و ممکن است به بروز مشکلات حاد در این زمینه منجر شود. بیوفیلم یک توده متراکم و ترکیب‌شده با میکروارگانیسم‌ها است. این باکتری‌ها به طور عمده شامل استرپتوکوکوس میتیس و سانگوئیس هستند. وجود بیوفیلم نیز باعث التهاب لثه و پریودنتیت می‌شود [8].

از ترکیبات مختلف شیمیایی ازجمله دهان‌شویه‌ها برای جلوگیری از بیماری‌های لثه، پریودنتیت و کاهش بیوفیلم استفاده می‌شود [10 ،9] که این ترکیبات معمولاً در کنار فواید، عوارضی نیز دارند [11]. اخیراً ترکیبات گیاهی برای کاهش بیوفیلم باکتریایی دهان مورد توجه قرار گرفته‌اند [13 ،12]. یکی از این ترکیبات نعناع فلفلی است. اثر این گیاه بر درمان عوارض سرماخوردگی اثبات و مشخص شده است که عوارض جانبی آن کم است. نعناع فلفلی حاوی 1/2 تا 1/5 اسانس اصلی است. منتول جزء اصلی اسانس نعناع فلفلی است که موجب تحریک جریان صفراوی، تسهیل آروغ زدن و خواص ضدباکتری است [15 ،14].

با توجه به اهمیت بیماری‌های پریودنتال و مقاومت آنتی‌بیوتیکی و عوارض داروهای شیمیایی، مطالعه حاضر با هدف بررسی خواص ضدباکتریایی احتمالی گیاه نعناع فلفلی بر تعدادی از میکروارگانیسم‌های شایع انجام شد.

مواد و روش‌ها

این پژوهش به صورت تجربی و آزمایشگاهی انجام شد. گیاه نعناع فلفلی به صورت تازه از گلخانه گیاهان دارویی و از کوه‌های منطقه فراهان اراک استان مرکزی تهیه و به صورت سنتی چند بار با آب شست‌وشو داده شد و سپس در محلی تاریک و دور از نور خورشید در دمای 2±24 یک هفته خشک و سپس آسیاب شد. روش‌های عصاره‌گیری الکلی و آبی انجام و از عصاره، رقت‌های مختلف تهیه شد. اسانس‌گیری با استفاده از دستگاه کلونجر انجام شد. در این دستگاه گیاه به طور مستقیم در یک بالن تقطیر داخل آب قرار گرفت؛ دو سوم حجم بالن با آب اشغال و سپس حرارت داده شد. بخارهایی که در این مرحله تولید می‌شوند، حاوی مولکول‌های اسانسی هستند. این بخارها پس از عبور از لوله‌های خنک‌کننده به صورت مایع درآمدند و در قسمت گیرنده جمع‌آوری شدند.

در این مطالعه، چهار سویه استاندارد خریداری‌شده از بانک میکروبی ایران شامل Eikenella corrodens PTCC 1391، Streptococcus Sanguis PTCC1449 ،Enterococcus Faecalis PTCC1778 و Actinomyces Viscosus PTCC1202 بررسی شدند. برای انجام آزمون حساسیت میکروبی به اسانس به روش دیسک دیفیوژن بعد از تهیه سوسپانسیون میکروبی با غلظت نیم مک فارلند (10×1.5 cfu/ml) کشت سوسپانسیون به صورت سفرهای روی محیط مولر هینتون آگار انجام شد و دیسک بلانک آغشته به 20 µl اسانس با غلظت‌های 1 و 0/1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر روی محیط کشت و در فاصله مناسب  با دیواره پلیت قرار داده شد. پلیت‌ها به مدت 48 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و بعد از سپری کردن دوره انکوباسیون قطر هاله عدم رشد باکتری بر حسب میلی‌متر اندازه‌گیری و ثبت شد.

 برای تعیین حساسیت میکروبی به روش میکروپلیت دایلوشن ابتدا سوسپانسیونی از باکتری‌هایی که از قبل کشت داده شده بودند و از زمان کشت آن‌ها 24-18 ساعت گذشته بود، تهیه شد و در مولر هینتون براث به کدورت نیم مک فارلند رسانده شد؛ سپس محتویات وارد میکروپلیت شدند. بدین صورت که 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری تا چاهک شماره 11 ریخته شد و100 میکرولیتر از میکروامولسیون اسانس نعناع فلفلی در چاهک اول ریخته شد و سریالی تا چاهک شماره 10 تهیه شد؛ سپس به مدت 48 ساعت میکروپلیت را انکوبه کرده و پس از 48 ساعت با دستگاه الایزاریدر Stat Fax 3200 ساخت کشور آمریکا در طول موج 545 نانومتر کدورت‌سنجی شد تا حداقل غلظت مهارکنندگی به دست آید. بعد از آن برای تعیین حداقل غلظت کشندگی از روش کشت و روش رنگ MTT استفاده شد. روش کشت بدین صورت بود که پلیت را تقسیم بندی کرده و برای هر سویه از شماره 1 تا 12 نوشته شد که شماره 11 مربوط به کنترل مثبت و تنها حاوی 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری بدون اسانس بود. شماره 12 مربوط به کنترل منفی بود، یعنی تنها 100 میکرولیتر محیط براث در آن بود؛ سپس به ترتیب شماره از هر چاهک هم ردیف همان سویه به میزان 10 میکرولیتر روی پلیت کشت داده شد؛ پلیت‌ها را تا 24 ساعت انکوبه کرده و فردای آن روز نتایج قرائت شد. اولین چاهک یا قسمتی که در آن رشد مشاهده شد، یک چاهک قبل از آن به عنوان حداقل غلظت کشندگی شد.

درواقع می‌توان این‌گونه تفسیر کرد که بعد از اتمام زمان انکوباسیون، آخرین رقت از لوله‌های حاوی سویه‌ها و اسانس گیاهی نعناع فلفلی که در محیط مولر هینتون آگار دارای رشد بوده و رقت بالاتر از آن فاقد رشد است، به عنوان حداقل غلظت کشندگی اسانس گیاه محاسبه شد. برای تعیین حداقل غلظت کشندگی از طریق روش رنگ MTT مقدار 10 میکرولیتر رنگ آماده‌شده MTT به تمام چاهک‌ها اضافه کردیم. بعد از 40 دقیقه انکوباسیون چاهک‌هایی که باکتری در آن‌ها زنده است، رنگ را احیا و تولید رنگ بنفش کرد و چاهک‌هایی که باکتری در آن‌ها از بین رفته بود، بدون تغییر باقی ماند. به این ترتیب چاهک قبل از اولین چاهک بنفش رنگ، حداقل غلظت کشندگی است.

برای بررسی تشکیل و قدرت چسبندگی بیوفیلم در میکروپلیت و ارزیابی کنترل تشکیل بیوفیلم در غلظت‌های مختلف توسط باکتری ابتدا در میکروپلیت به مقدار 170 میکرولیتر محیط کشت آماده شد؛ سپس 20 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری و 10 میکرولیتر ماده ضدمیکروبی اضافه شد. بعد از گذشت 48 ساعت چاهک‌ها تخلیه و شست‌وشو داده شد. پس از خشک شدن چاهک‌ها با استفاده از اتانول 95 درصد بیوفیلم‌ها حل و سپس چگالی نوری به وسیله الایزاریدر خوانده شد.

برای انجام تست سنجش بیوفیلم ابتدا باکتری‌ها به مدت 18 الی 24 ساعت در محیط مناسب کشت داده شدند؛ سپس از کلنی‌های تک و یکسان سه کلنی برداشته شد و در مقداری محیط BHI کشت داده شد. در مرحله بعد سوسپانسیون کشت‌داده‌شده به مدت 3 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد و سپس 20 میکرولیتر از سوسپانسیون و 180 میکرولیتر از محیط حاوی نمک روی میکروپلیت پلی استایرن انتقال داده شد. میکروپلیت به مدت 48 ساعت انکوبه و پس از گذشت 48 ساعت محتویات چاهک‌ها به‌آرامی خارج شد و دو مرتبه با آب مقطر استریل شست‌وشو داده شد؛ سپس 200 میکرولیتر کریستال ویوله 1/0 درصد در چاهک‌ها ریخته و به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. رنگ به‌آرامی با سمپلر خالی شد و سپس چاهک‌ها دو مرتبه با آب مقطر استریل شست‌وشو داده شدند. درنهایت به‌آرامی روی دستمال کاغذی ضربه زده شد تا آب چاهک‌ها خالی شود. در این مرحله اجازه داده شد که چاهک‌ها در دمای اتاق خشک شوند و سپس برای ارزیابی نسبی تشکیل بیوفیلم 200 میکرولیتر اتانول 95 درصد بری حل شدن رنگ مرتبط با سطح به چاهک‌ها زده و به مدت 10 الی 15 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد؛ سپس محتویات هر چاهک با استفاده از پیپتینگ مخلوط شد و 125 میکرولیتر از این محلول در طول موج 545 نانومتر به وسیله دستگاه الایزاریدر اندازه‌گیری شد. بیوفیلم هر سویه به صورت سه‌تایی گذاشته شد و میزان بیوفیلم توسط محاسبه میانگین بیوفیلم تشکیل‌شده این سه چاهک و مقایسه آن با جذب نوری کنترل منفی به دست آمد.

نتایج

مقادیر قطر هاله‌های عدم رشد مربوط به غلظت‌های مختلف اسانس نعناع فلفی بر حسب میلی‌متر در جدول شماره 1 نشان داده شده است.

نتایج این تست نشان می‌دهد که اسانس با غلظت g/ml 0/1 از گیاه اثر مهاری بر رشد انتروکوک فکالیس و استرپتوکوک سانگوئیس دارد؛ همچنین قوی‌ترین اثر اسانس خالص گیاه برای استرپتوکوک سانگوئیس و ضعیف‌ترین اثر برای ایکنلا کورودنس را نشان داد. نمونه‌ای از تأثیر اسانس نعناع فلفلی با غلظت g/ml 1 بر رشد باکتری انتروکوکوس فکالیس در تصویر شماره 1 نشان داده شده است.

نتایج حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی اسانس گیاه نعناع فلفلی در تصویر شماره 2 نشان داده شده است.

بر اساس نتایج، حداقل غلظت کشندگی قوی‌ترین اثر اسانس گیاه برای باکتری ایکنلا کورودنس (mg/ml 1/562) و ضعیف‌ترین اثر اسانس گیاه برای باکتری انتروکوک فکالیس (mg/ml 12/5) به دست آمد؛ همچنین حداقل غلظت مهارکنندگی برای باکتری اکتینومایسس ویسکوز ضعیف‌تر (mg/ml 3/125) و برای سه باکتری دیگر قوی‌تر و برابر (mg/ml 1/562) به دست آمد.

نتایج میزان چگالی نوری در آزمایش میکروپلیت دایلوشن مربوط به غلظت‌های مختلف اسانس گیاه نعناع فلفلی در تصویر شماره 3 نشان داده شده است.

نتایج میزان آزمایش مهار تشکیل بیوفیلم مربوط به اسانس نعناع فلفلی مربوط به غلظت‌های مختلف اسانس گیاه در تصویر شماره 4 نشان داده شده است.

نتایج این تست نشان داد که باکتری انتروکوکوس فکالیس ایکنلا کورودنس تا چاهک 3 یعنی تا غلظت 12/5، استرپتوکوکوس سانگوئیس تا چاهک 2 یعنی تا غلظت 25 و باکتری اکتینومایسس ویسکوز تا چاهک 4 یعنی با غلظت 6/25 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر از اسانس گیاه نعناع فلفلی رشد نکرده‌اند.

بحث

در پژوهش حاضر فعالیت ضدباکتریایی اسانس گیاه نعناع فلفلی بررسی شد. روش مورد استفاده دیسک دیفیوژن و میکروپلیت دایلوشن بود. نتایج تست دیسک دیفیوژن بیان داشت که اسانس با غلظتg/ml 0.1 از گیاه، اثر مهاری بر رشد انتروکوک فکالیس و استرپتوکوک سانگوئیس دارد. اسانس خالص گیاه به‌ترتیب از قوی‌ترین اثر به ضعیف‌ترین روی استرپتوکوک سانگوئیس‌، انتروکوک فکالیس، اکتینومایسس ویسکوز و ایکنلا کورودنس اثر مهاری نشان داد. نتایج تست میکروپلیت دایلوشن بیان داشت که اسانس گیاه، اثر مهاری بر رشد هر چهار باکتری دارد. حداقل غلظت کشندگی برای باکتری‌ها از قوی‌ترین اثر اسانس به ضعیف‌ترین شامل ایکنلا کورودنس، اکتینومایسس ویسکوز، استرپتوکوک سانگوئیس و انتروکوک فکالبس بود. حداقل غلظت مهارکنندگی برای باکتری انتروکوک فکالیس کمتر از سه باکتری دیگر برابر بود. تست سنجش بیوفیلم در این باکتری‌ها نشان داد که اسانس گیاه نعناع فلفلی بر روند تشکیل بیوفیلم در هر چهار باکتری اثر مهاری داشت و این اثر مهاری به‌ترتیب از قوی‌ترین به ضعیف‌ترین برای باکتری اکتینومایسس ویسکوز، انتروکوک فکالیس، ایکنلا کورودنس و استرپتوکوک سانگوئیس بود.

نتایج برخی از مطالعات با مطالعه حاضر همخوان است. در مطالعه‌ای که در مورد اثر آنتی‌باکتریال گیاه نعناع روی دو باکتری استرپتوکوک سانگوئیس و استرپتوکوک موتانس انجام شد، حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی بررسی شد که نتایج این مطالعه با نتایج مطالعه حاضر همخوانی داشت؛ البته در مطالعه مذکور از عصاره گیاه نعناع زینتی استفاده شده که از این لحاظ با مطالعه ما متفاوت بود [16]. در مطالعه دیگری، اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد باکتری‌های اشریشیای کولی، آئروموناس هیدروفیلیا،  استافیلوکوک اورئوس و انتروکوکوس فاسیوم پس از استفاده از اسانس برگ نعناع فلفلی انجام شد که این مطالعه نیز نتایچ مشابهی با مطالعه ما داشت، با این تفاوت که گونه‌های مورد بررسی باکتریایی در مطالعه مذکور با مطالعه ما یکسان نبود [17]. در مطالعه دیگری اثر ضد باکتریایی عصاره گیاه نعناع بر پاتوژن‌های انسانی مقاوم به آنتی‌بیوتیک بررسی شد. یکی از باکتری‌هایی که در آن مطالعه بررسی شد، انتروکوک فکالیس بود که در مطالعه حاضر نیز بررسی شد. نتایج مطالعه مذکور مشابه با مطالعه ما بود. هر دو مطالعه حاکی از وجود اثر مهاری این گیاه بر باکتری انتروکوک فکالیس بود [18]. در مطالعه دیگری اثر نعناع در یک عصاره ترکیبی شامل سه گیاه گواوا، انبه و نعناع بر مهار بیوفیلم باکتریایی بررسی شد. در این مطالعه نشان داده شد که عصاره ترکیبی گیاهان مذکور، چسبندگی باکتریایی استرپتوک میتیس و استرپتوکوک سانگوئیس را کاهش می‌دهد. البته در مطالعه مذکور از مدل دهان مصنوعی برای سنجش بیوفیلم استفاده شد، اما نتایج هر دو مطالعه نشان داد که گیاه نعناع بر تشکیل بیوفیلم اثر مهاری دارد [19].

در مطالعه حاضر محدودیت‌هایی نیز وجود داشت که ازجمله آن‌ها می‌توان به کم بودن انواع سویه‌های باکتری مورد مطالعه، سخت بودن کشت دادن برخی از پاتوژن‌ها مثل پورفیروموناس ژینژیوالیس و همچنین عدم مطالعات مشابه انسانی و در شرایط In vivo برای مقایسه نتایج مطالعه حاضر با آن‌ها اشاره کرد. نتایج اندک تست دیسک دیفیوژن در این بررسی، علی‌رغم تکرار سه مرتبه‌ای تست، حاکی از اثر ضعیف گیاه روی باکتری‌های موردنظر بود. این مسئله را می‌توان به حساسیت کمتر تست دیسک دیفیوژن نسبت به سایر روش‌ها ارتباط داد. نتایج قطعی و حساس‌تر بررسی این گیاه روی باکتری‌های مورد نظر را می‌توان در تست‌های میکروپلیت و بررسی بیوفیلم سنجید. علی‌رغم وجود این محدودیت‌ها و با توجه به نتایج این مطالعه، اسانس این گیاه می‌تواند در صنایع دارویی در آینده برای کنترل رشد و تشکیل بیوفیلم توسط این باکتری‌ها همچنین برای کنترل و پیشگیری بیماری‌های پریودنتال استفاده شود. لازم به ذکر است که به مطالعات بیشتری در ارتباط با بررسی اثرات اسانس گیاه بر بافت‌های دهان انسان نیاز خواهد بود. این مطالعه می‌تواند راهنمایی برای مطالعات بعدی در مدل‌های شبیه‌سازی‌شده انسانی و همچنین مطالعات In Vivo باشد.

نتیجه‌گیری

نتایج این مطالعه نشان داد که گیاه نعناع فلفلی دارای خاصیت آنتی‌باکتریال بر باکتری‌های ایکنلا کورودنس، اکتینومایسس ویسکوز، استرپتوکوک سانگوئیس و انتروکوک فکالیس است. اثر مهاری اسانس این گیاه نیز نشان داده شد؛ لذا می‌توان گفت که گیاه نعناع فلفلی به عنوان یک آنتی‌باکتریال طبیعی و مؤثر، کاربرد احتمالی در پیشگیری از بیماری‌های پریودنتال دارد.

ملاحظات اخلاقی

پیروی از اصول اخلاق پژوهش

این مطالعه با کد اخلاق IR.ARAKMU.REC.1397.15 به تصویب کمیته اخلاق معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک رسید.

حامی مالی

این پژوهش حامی مالی نداشته است.

مشارکت نویسندگان

تمامی نویسندگان معیارهای استاندارد نویسندگی بر اساس پیشنهادات کمیته بین‌المللی ناشران مجلات پزشکی را دارا بودند.

تعارض منافع

نویسندگان بدین‌وسیله تصریح می‌کنند که هیچ‌گونه تضاد منافعی در خصوص پژوهش حاضر وجود ندارد.

تشکر و قدردانی

این مطالعه هیچ‌گونه حامی مالی نداشته است. بدین‌وسیله از همکاری‌های دانشگاه علوم پزشکی اراک در انجام این پژوهش تشکر و قدردانی می‌شود.

 

References

1.Heng C. Tooth decay is the most prevalent disease. Fed Pract. 2016; 33(10):31-3. [PMID] [PMCID]

2.Aas JA, Griffen AL, Dardis SR, Lee AM, Olsen I, Dewhirst FE, et al. Bacteria of dental caries in primary and permanent teeth in children and young adults. J Clin Microbiol. 2008; 46(4):1407-17. [DOI:10.1128/JCM.01410-07] [PMID] [PMCID]

3.Kim J, Amar S. Periodontal disease and systemic conditions: A bidirectional relationship. Odontology. 2006; 94(1):10-21. [DOI:10.1007/s10266-006-0060-6] [PMID] [PMCID]

4.Nazir MA. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. Int J Health Sci. 2017; 11(2):72-80. [PMID] [PMCID]

5.Pihlstrom BL, Michalowicz BS, Johnson NW. Periodontal diseases. Lancet. 2005; 366(9499):1809-20. [DOI:10.1016/S0140-6736(05)67728-8]

6.Lovegrove JM. Dental plaque revisited: Bacteria associated with periodontal disease. J N Z Soc Periodontol. 2004; (87):7-21. [PMID]

7.Berger D, Rakhamimova A, Pollack A, Loewy Z. Oral biofilms: Development, control, and analysis. High-Throughput. 2018; 7:24. [DOI:10.20944/preprints201808.0174.v1]

8.Lasserre JF, Brecx MC, Toma S. Oral microbes, biofilms and their role in periodontal and peri-implant diseases. Materials. 2018; 11(10):1802. [DOI:10.3390/ma11101802] [PMID] [PMCID]

9.Ouhayoun JP. Penetrating the plaque biofilm: Impact of essential oil mouthwash. J Clin Periodontol. 2003; 30(s5):10-2. [DOI:10.1034/j.1600-051X.30.s5.4.x] [PMID]

10.Jones SB, West NX, Nesmiyanov PP, Krylov SE, Klechkovskaya VV, Arkharova NA, et al. The antibacterial efficacy of a foam mouthwash and its ability to remove biofilms. BDJ Open. 2018; 4:17038. [DOI:10.1038/s41405-018-0005-5] [PMID] [PMCID]

11.da Costa LFNP, da Silva Furtado Amaral C, da Silva Barbirato D, Leão ATT, Fogacci MF. Chlorhexidine mouthwash as an adjunct to mechanical therapy in chronic periodontitis: A meta-analysis. J Am Dent Assoc. 2017; 148(5):308-18. [DOI:10.1016/j.adaj.2017.01.021] [PMID]

12.Karim B, Bhaskar DJ, Agali C, Gupta D, Gupta RK, Jain A, et al. Effect of Aloe vera mouthwash on periodontal health: Triple blind randomized control trial. Oral Health Dent Manag. 2014; 13(1):14-9. [PMID]

13.Shoae Hassani A, Hamdi K, Ghaemi A. [In vitro Reduction in Colonization of Streptococcus mutans by honey beeswax ethyl acetate extract (Persian)]. J Arak Univ Med Sci. 2008; 11(4):87-95. http://jams.arakmu.ac.ir/article-1-290-en.html

14.Imai H, Osawa K, Yasuda H, Hamashima H, Arai T, Sasatsu M. Inhibition by the essential oils of peppermint and spearmint of the growth of pathogenic bacteria. Microbios. 2001; 106 Suppl 1:31-9. [PMID]

15.Liang R, Xu Sh, Shoemaker CF, Li Y, Zhong F, Huang Q. Physical and antimicrobial properties of peppermint oil nanoemulsions. J Agric Food Chem. 2012; 60(30):7548-55. [DOI:10.1021/jf301129k] [PMID]

16.Shafiei Z, Haji Abdul Rahim Z, Philip K, Thurairajah N. Antibacterial and anti-adherence effects of a Plant Extract Mixture (PEM) and its individual constituent extracts (Psidium sp., Mangifera sp., and Mentha sp.) on single- and dual-species biofilms. PeerJ. 2016; 4:e2519. [DOI:10.7717/peerj.2519] [PMID] [PMCID]

17.Abdel-Hameed ESS, Salman MS, Fadl MA, Elkhateeb A, El-Awady MA. Chemical composition of hydrodistillation and solvent free microwave extraction of essential oils from Mentha piperita L. Growing in Taif, Kingdom of Saudi Arabia, and their anticancer and antimicrobial activity. Orient J Chem. 2018; 34(1):222-33. [DOI:10.13005/ojc/340125]

18.Shalayel MHF, Asaad AM, Qureshi MA, Elhussein AB. Anti-bacterial activity of peppermint (Mentha piperita) extracts against some emerging multi-drug resistant human bacterial pathogens. J Herb Med. 2017; 7:27-30. [DOI:10.1016/j.hermed.2016.08.003]

19.Wan Nordini Hasnor WI, Fathilah AR, Rahim ZHA. Plant extracts of Psidium guajava, Mangifera and Mentha sp. inhibit the growth of the population of single-species oral biofilm. Altern Integr Med. 2013; 2(1):1000102. [DOI:10.4172/2327-5162.1000102]